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钙离子对TRPC6和TRPC7的相反调节机制

作　者: 史娟
导　师: 李继硕
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 人体解剖学与组织胚胎学
关键词: TRP Ca2+ 膜片钳
分类号: R33
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

非电压门控性钙流入（non-voltage-gated calcium entry, NVGCE）在许多兴奋性细胞和非兴奋性细胞中发挥着重要作用。其中，受体激活钙通道（receptor-activated calcium entry channel, RACC）对平滑肌细胞收缩，淋巴细胞激活，腺体分泌等细胞生理功能尤为重要，但长期以来由于分子实体不详而导致对该通道的研究大大滞后于其它钙通道，如配体门控钙通透性离子通道和环核苷酸激活的钙通道等。许多关键问题，如通道的激活和调节机制仍然存在许多争议。瞬时感受器电位（transient receptor potential, TRP）基因的发现为这一领域打开了新局面。由于其编码产物属于钙通透性离子通道，且在许多特征上和RACC极为相似，TRP目前已被认为是RACC的首要候选分子。研究TRP通道的激活和调节机制将对最终理解在体RACC的生理功能具有十分重要的意义。本研究将异源表达技术和电生理膜片钳技术相结合，探讨了Ca²⁺对TRP家族的两个同源蛋白——TRPC6和TRPC7的调节机制。将小鼠的TRPC6和TRPC7表达于人胚肾细胞（human embryonic kidney, HEK），在致霉菌素穿孔膜片钳记录中，100μM的拟乙酰胆碱类药物卡巴可（carbachol, CCh）诱发出很大的内向电流（钳制电压，-60mV）。该电流在对照组细胞中未能记录到，表明其源自于外源性表达的TRPC6和TRPC7通道蛋白。细胞外Ca²⁺(Ca²⁺_o，1mmol/L)对TRPC6/TRPC7电流呈现相反调节：对前者是双向效应，先增强后抑制（在有些细胞中，增强效应又可区分为最初的“噪音”样快增强和其后的慢增强，而表现为三向效应），而对后者则表现出强烈的单向抑制。用含有10mmol/L BAPTA的电极内液来透析细胞，并进行传统膜片钳记录发现，细胞外Ca²⁺仍然呈浓度依赖性地抑制TRPC7电流（虽然伴随着一个右移的浓度效应曲线），而对TRPC6的双向或三向效应甲四军医人学谭士研鬼主学位论文则改变为单向的“噪音”样快增强。这些结果提示，细胞内Ca’“也在通道调节中发挥重要作用。在细胞内朝外（inside－out recordins 1／0）的单通道记录中，TRPC6电流呈现双向的细胞内Ca’”浓度（【Ca’”」；）依赖性，表现为强的微摩尔浓度范围内的增强效应和弱的纳摩尔浓度范围抑制效应。与此相反，TRPC7电流则只被纳摩尔Ca’“；浓度依赖性地抑制。Ca’“；对 TRPC6和 TRPC7的以上调节可以被一种有效的钙调蛋白抑制剂calmNazohu。或共表达对k’”；不敏感的突变体钙凋蛋白（mU上a。t ca1moduhn，一tCaM）所消除，提示钙调蛋白（calmodulin，CaM）参与其中。为了进一步研究CaM的作用部位，我们组建了 TRPC6／7 e合体（以氨基端，跨膜区，竣基端的）IM序命名为 T667和 T776)重复以上试验，发现骏基端决定TRPC6和TRPC7细胞内钙离子调节特性，而跨膜区则决Hq旧m团q卜至K留叫卜u司n牢午’w。锅了卜，下干丫田＿侧居y L lflosllO且 1，兮．b 工rls＊nOS口＊＊Ie，1h／还以与k’“／CaM相竞争的方式增强 TRPC7、T667单通道电流，而对 TRPC6及 T776则没有影响。以上结果表明，（）TRPC6和TRPC7具有不同的钙离子调节特性：TRPC7接受细胞外和细胞内钙离子的抑制性调节，前者可能是由于钙离子通透受阻，后者则源自CaM依赖性钙抑制；TRPC6呈现双向的细胞内外钙离子浓度依赖性，抑制效应不及TRPC7强烈，而增强性非常突出。（2）跨膜区决定细胞外钙离子效应，竣基端决定细胞内钙离于效应。（s）IP。以与 Ca’＋／CaM竞争的方式增强 TRPC7通道电流，而对 TRPC6则没有明显影响。在 TRPC家族的七个成员中，TRPCI和 TRPC3己被证明接受细胞内h’”／CaM介导的抑制性调节。本研究表明，TRPC7也具有相类似的调节机制。另外，TRPC6虽然与TRPC7有75％的氨基酸序列同源性，却表现出相反的Ca’“／CaM依赖性。根据我们以前的研究结果，TRPC6是血管平滑肌a；肾上腺素受体激活的离子通道的重要组分，TRPC6的这种特殊的调节特性对于理解交感神经兴奋诱发效应的细胞分子机制具有重要意义。

全文目录

缩略语表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
综述:TRP离子通道   10-21
论文 Differential regulation by calcium of two closely related TRP homologues TRPC6 and TRPC7  21-59
论文发表情况  59-60
致谢  60

钙离子对TRPC6和TRPC7的相反调节机制

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