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p38 MAPK和ERK在内毒素诱导的iNOS表达中的作用

作　者: 阚文宏
导　师: 赵克森；姜勇
学　校: 第一军医大学
专　业: 病理生理学
关键词: 休克脂多糖（LPS）诱导型一氧化氮合酶（iNOS）信号转导丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）平均动脉压（MAP）多器官功能不全综合征（MODS）一氧化氮（NO）血管内皮细胞巨噬细胞
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

在败血症(内毒素血症)以及多器官功能不全综合征(MODS)过程中，致炎因子和内毒素(LPS)可引起多种组织和细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达，从而产生大量一氧化氮(NO)。虽然NO和iNOS在全身炎症反应或内毒素性休克中的作用得到了广泛的研究，但是由于在iNOS产生过程中存在着多种影响因素，因此iNOS诱导表达的信号转导机制机制目前仍不十分清楚。本研究应用分子生物学、细胞生物学等方法，从细胞、组织、整体三个层次进行了系统研究，目的是探讨p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)和p44／42MAPK(ERK1／2或ERK)信号转导通路在LPS诱导的人类内皮细胞ECV304、小鼠巨噬细胞RAW264.7以及BALB／c小鼠整体水平iNOS表达和NO产生中的作用。在细胞水平研究中，利用人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)-ECV304和小鼠巨噬细胞-RAW264.7，用Griess法检测细胞培养液中NO产生水平，分别用免疫荧光法(或Western blot)和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞iNOS蛋白和mRNA表达，采用免疫激酶沉淀、放射自显影以及Western blot检测细胞p38MAPK和ERK的活性。结果表明，LPS可显著激活两种细胞中p38 MAPK和ERK信号途径，其激活高峰在LPS刺激后15～20 min，45 min后活性逐渐下降。用MAPK特异性抑制剂SB203580和PD98059处理细胞后可以分别完全抑制LPS诱导的这两种细胞p38 MAPK和ERK的活性。与对照组相比，LPS刺激后的ECV304和RAW264.7细胞iNOS蛋白和mRNA的表达明显增加，培养基中NO水平也显著升高，用SB203580和PD98059预处理这两种细胞后，发现SB203580可显著抑制LPS诱导的细胞iNOS表达和NO过量产生，PD98059仅能显著抑制ECV304细胞iNOS表达和NO产生，而对RAW64．7则无抑制作用。从而表明p38 MAPK和EKK均参与了LPS介导的人血管内皮细胞WOS表达和NO产生的信号传递，而巨噬细胞 iNOS表达只有 p38 MAPK通路参与，ERK并未介导其表达。在组织水平的研究中，选用BALB／。小鼠复制内毒素休克动物模型，同时分别观察LPS诱导组织iNOS表达的时间过程、量效关系、及p38MAPK和EI；UC在其中的作用。首先对麻醉的动物进行颈动脉插管，用生理记录仪检测平均动脉压（MAP），分别用LPS、SB203580＋LPS以及PD98059＋LPS处理动物后，收集血液，并取心、脾、肺、肝／肾、肠等组织样本，分别用 Western blot和 RT－PCR检测组织 oOS蛋白和 tnKNA表达，采用免疫激酶活性法检测组织p38 MAPK和ERK的活性，并用HE染色对各组动物的组织进行病理学检查。结果表明，l）内毒素休克小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠等组织中WOS基因转录和蛋白表达均明显增多，并随着所用LPS的剂量的增加和处理时间的延长，rOS表达也相应增多；2）在正常小鼠肺中就有少量iNOS表达（其它正常组织中无表达），LPS处理后，肺中rOS表达最早，水平最高；3）LPS处理的小鼠肺 rOS表达增高的同时，p3 8 MAPK和 ERK信号转导通路也被激活；用MAPK特异性抑制剂SB203580和PD98059后，可分别抑制肺组织 p38 MAPK和 ERK的激活，并能显著减低组织中 iNOS InRNA和蛋白的表达，表明 p38 MAPK和 E胀均参与了内毒素休克小鼠组织 iNOS表达的信号转导；4）组织病理学结果表明，实验组所有器官及组织均显充血改变；正常组与实验组各器宫（心、肝、脾、肺、肾、肠等）实质细胞组织病理学检查无显著性差异。LPS、SB＋LPS、PD＋LPS组动物均显示肾远曲及近曲小管上皮细胞轻一中度水变性；肝细胞轻一中度水变性或脂肪变性；肺、心肌、脾、肠胃组织未见明显病变。整体水平研究中，腹腔注射LPS后可引起BALB／C小鼠双峰型进行性的动脉血压下降，6 h后达到重度休克，而后收集血液，用 Gness法检测血浆中NO。结果发现内毒素休克小鼠血浆NO浓度明显升高，分别用p38和ERK抑制剂处理的动物血浆NO水平明显下降，但仍显著高于正常对照组，这两种抑制剂对血压下降并无影响。提示p38 MAPK和ERK在LPS诱导的iNOS表达和NO产生增加过程中起重要作用，但也不排除有其它信号途径的参与。．2－通过上述研究，可以得出以下结论： 1．正常肺组织就有少量iNOS表达（包括mRNA和蛋白），而在其它正常器官则检测不到其表达；内毒素休克时心、肝、脾、肺、肾、肠中均有iNOS表达增多，其中以肺脏最为显著，提示了肺在感染、休克和多器官功能不全（MODS）发生中具有较高的易伤性。 2．p38和 ERK两条通路介导了 LPS诱导的人血管内皮细胞iNOS表达和 NO的产生，而小鼠巨噬细胞iNOS表达的信号过程只有p38通路参与。提示在LPS处理后，不同种属的动物、不同类型的细胞rOS表达的信号转导过程有一定差异。 3．用 p38通路抑韦剂（SB203580）和 EKK途径抑讳剂（PD98059）可显著抑制由LPS所致的多种器官和细胞iNOS表达，因而可阻止内毒素休克动物血中NO过度上升，提示阻抑细胞信号转导通路，有可能为防治感染、休克以及MODS时炎性介质过量生成提出一条新思路。 4．本工作建立了小鼠内毒素休克模型，记录出典型的血压变?

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-12
前言  12-16
材料与方法  16-25
结果  25-56
讨论  56-63
参考文献  63-76
综述  76-108
英文缩略词表  108-114
在读博士期间发表的论文  114-115
致谢  115-116

p38 MAPK和ERK在内毒素诱导的iNOS表达中的作用

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