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恶性疟原虫氯喹抗性株Fcc SM_1/yN株对多种抗疟药敏感性差异的分子生物学研究
作 者: 权红
导 师: 汤林华
学 校: 中国疾病预防控制中心
专 业: 流行病与卫生统计学
关键词: 恶性疟原虫氯喹抗性株 抗药性 增效或逆转 pfcrt基因 pfmdr1基因 差异
分类号: R531.3
类 型: 博士论文
年 份: 2008年
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内容摘要
目的比较多种抗疟药作用后恶性疟原虫氯喹抗性株Fcc SM1/yN株pfcrt基因和pfmdr1基因在DNA水平和RNA表达水平上的差异,研究Fcc SM1/yN株对多种抗疟药敏感性差异的分子生物学基础,探讨抗性与药物作用相互关系的分子机制,为研发有效杀灭抗性恶性疟原虫的新药提供线索。方法(1)采用WHO推荐的Rieckmann体外微量法和巢式PCR-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)鉴定Fcc SM1/yN株是否为恶性疟原虫氯喹抗性株;确定氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、酮替芬和赛庚啶对Fcc SM1/yN株的IC50值,并进行酮替芬和赛庚啶提高体外培养的Fcc SM1/yN株对氯喹反应性的研究;(2)通过PCR扩增、巢式PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)等分子生物学方法研究氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、氯喹/酮替芬组合以及氯喹/赛庚啶组合作用后Fcc SM1/yN株pfcrt基因和pfmdr1基因在DNA水平上的差异。(3)通过RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法研究以上四种抗疟药以及两种抗疟药组合作用后Fcc SM1/yN株pfcrt基因和pfmdr1基因在转录水平上的差异。结果(1)体外微量法显示在氯喹32pmol孔依然有4~5个裂殖体形成,按照氯喹抗性标准判定Fcc SM1/yN株为恶性疟原虫氯喹抗性株,而在64pmol孔裂殖体形成受到完全抑制,则Fcc SM1/yN株对氯喹的抗性指数为32。(2)巢式PCR-RFLP分析以及对第二轮PCR扩增产物的测序结果显示Fcc SM1/yN株在76位点发生了K76T突变,并且该虫株携带编码氨基酸SVMNT(残基72~76)的pfcrt等位基因。(3)通过体外微量法确定氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、酮替芬和赛庚啶对Fcc SM1/yN株的IC50值分别为128.95nmol/L(95%可信区间为119.36~138.53nmol/L)、20.16nmol/L(95%可信区间为15.67~24.65nmol/L)、201.2nmol/L(95%可信区间为137.46~266.11nmol/L)、7.53μmol/L(95%可信区间为6.84~8.22μmol/L)、94.17μmol/L(95%可信区间为73.32~115.03μmol/L)和106.74μmol/L(95%可信区间为82.07~131.41μmol/L)。(4)0.0098μmol/L~0.078μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L-2560nmol/L的氯喹配伍,氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值均在128nmol/L左右,表明对氯喹没有任何协同作用;0.15625μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L~2560nmol/L的氯喹配伍,仅氯喹浓度10nmol/L孔和20nmol/L孔各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目比单加氯喹的相应孔略有减少,氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值分别为108.2nmol/L(95%可信区间为97.48~118.93nmol/L)(氯喹/酮替芬组合)和113.74nmol/L(95%可信区间为102.83~124.64nmol/L)(氯喹/赛庚啶组合),活性提高指数([无增效剂时的氯喹IC50值-增效剂存在时的氯喹IC50值]/无增效剂时的氯喹IC50值)分别为0.16(氯喹/酮替芬组合)和0.12(氯喹/赛庚啶组合),表明对氯喹活性有微弱的增效作用;0.3125μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L~2560nmol/L的氯喹配伍,仅氯喹浓度5nmol/L孔、10nmol/L孔和20nmol/L孔各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目相对于单加氯喹的相应孔有所减少,氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值分别为88nmol/L(95%可信区间为75.76~100.24nmol/L)(氯喹/酮替芬组合)和97.39nmol/L(95%可信区间为86.02~108.77nmol/L)(氯喹/赛庚啶组合),活性提高指数分别为0.32(氯喹/酮替芬组合)和0.25(氯喹/赛庚啶组合),表明对氯喹活性的增效作用更强些;0.625μmol/L的酮替芬或赛庚啶与0.3125nmol/L~2560nmol/L的氯喹配伍,同样也是仅氯喹浓度5nmol/L孔、10nmol/L孔和20nmol/L孔各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目相对于单加氯喹的相应孔有所减少,氯喹对FccSM1/yN株的IC50值分别为74.53nmol/L(95%可信区间为64.8~84.26nmol/L)(氯喹/酮替芬组合)和89.7nmol/L(95%可信区间为77.7~101.7nmol/L)(氯喹/赛庚啶组合),活性提高指数分别为0.42(氯喹/酮替芬组合)和0.3(氯喹/赛庚啶组合),表明对氯喹活性有更加明显的增效作用。另外,0.625μmol/L酮替芬或赛庚啶+5nmol/L氯喹各孔200个疟原虫中3个核以上裂殖体的平均数目相对于单加5nmol/L氯喹的相应孔减少程度比其他配伍剂量高(P<0.05),表明对于本研究这个配伍组合提高氯喹活性的效能最高;1.25μmol/L~5μmol/L的酮替芬或赛庚啶单独应用已有较明显的抑虫效果,与氯喹配伍时药物的单独效应仍占主要优势;氯喹作用0~7小时加酮替芬或赛庚啶,各时间段氯喹对Fcc SM1/yN株的IC50值没有明显差别,仅在第5小时稍有降低,到第6和第7小时达到高峰,分别为67.7nmol/L(95%可信区间为58.02~77.37nmol/L)(氯喹/酮替芬组合)和81.53nmol/L(95%可信区间为65.95~97.19nmol/L)(氯喹/赛庚啶组合),活性增高指数分别为0.47(氯喹/酮替芬组合)和0.37(氯喹/赛庚啶组合),8小时以后IC50值恢复为128nmol/L左右。(5)检测K76T和N86Y突变的巢式PCR-RFLP反应以及对第二轮扩增产物的测序结果显示,Fcc SM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后都存在pfcrt基因的K76T突变和pfmdr1基因的N86Y突变;而检测D1246Y突变的巢式PCR-RFLP反应结果则显示,Fcc SM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后以及作为对照的氯喹敏感株Fcc/HN株中都不存在D1246Y突变,对第二轮扩增产物的测序结果也显示Fcc SM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后都不存在D1246Y突变,表明Fcc SM1/yN株疟原虫pfmdr1基因的1246位点并没有发生突变,依然保持着野生株的基因型;对以上3个巢式PCR反应第二轮扩增产物的测序结果以及序列比对结果显示FccSM1/yN株疟原虫在6种药物和药物组合作用前后这3个片段的序列没有差异。(6)氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、氯喹/酮替芬组合以及氯喹/赛庚啶组合以一个IC50值的剂量或一个最佳配伍剂量作用于Fcc SM1/yN株疟原虫,至少在20小时左右的作用时间里,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因和pfmdr1基因在RNA表达水平上没有差别。但统计结果显示,氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用前后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平有差别(p<0.05),氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用前后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平有差别(p<0.05)。即氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平提高,氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用后Fcc SM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平降低。提示一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平有上调的趋势,一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用后FccSM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平有下调的趋势。RT-PCR结果显示,以内参条带亮度为标准,pfcrt和pfcrt基因各条带亮度一致,表明基因表达水平没有差别,与实时荧光定量PCR方法得到的结果一致。结论(1)Fcc SM1/yN株为恶性疟原虫氯喹抗性株。(2)适当的氯喹/酮替芬或者氯喹/赛庚啶配伍能够增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株Fcc SM1/yN株对氯喹的反应性,其中,同样浓度的酮替芬比赛庚啶对氯喹的增效作用强;氯喹作用0~6h内加酮替芬或赛庚啶对氯喹增效作用无明显差别,6~7h时加入增效效果明显,8h之后再加对氯喹已没有增效作用。(3)氯喹、青蒿素、蒿甲醚、瑞香素、氯喹/酮替芬组合以及氯喹/赛庚啶组合以一个IC50值的剂量或一个最佳配伍剂量作用于Fcc SM1/yN株疟原虫,至少在34h左右的作用时间里,都不使FccSM1/yN株疟原虫pfcrt和pfmdr1基因在DNA水平上发生任何改变。(4)上述抗疟药和药物组合以同样的剂量作用于Fcc SM1/yN株疟原虫,至少在20h左右的作用时间里,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt和pfmdr1基因在RNA表达水平上没有差别。统计学处理结果则提示,一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹、青蒿素和氯喹/酮替芬组合作用后,Fcc SM1/yN株疟原虫pfcrt基因表达水平有上调的趋势,一个IC50值或一个最佳配伍剂量的氯喹和氯喹/赛庚啶组合作用后FccSM1/yN株疟原虫pfmdr1基因表达水平有下调的趋势。
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全文目录
中文摘要 5-9 英文摘要 9-13 前言 13-16 第一部分 Fcc SM_1/yN株对多种抗疟药的敏感性研究以及酮替芬和赛庚啶提高Fcc SM_1/yN株对氯喹反应性的研究 16-43 前言 16-17 第一节 Fcc SM_1/yN株对多种抗疟药的敏感性研究 17-33 材料和方法 17-24 结果 24-33 第二节 酮替芬和赛庚啶提高FeeSM_1/yN株对氯喹反应性的研究 33-35 前言 33-34 材料和方法 34-35 结果 35-43 第二部分 多种抗疟药或组合作用后Fcc SM_1/yN株pfcrt和pfmdr1基因在DNA水平上的差异 43-59 前言 43-45 第一节 多种抗疟药或组合作用后Fcc SM_1/yN株pfcrt基因在DNA水平上的差异 45-48 材料和方法 45-46 结果 46-48 第二节 多种抗疟药或组合作用后Fcc SM_1/yN株pfmdr1基因在DNA水平上的差异 48-59 材料和方法 48-52 结果 52-59 第三部分 多种抗疟药或组合作用后Fcc SM_1/yN株pfcrt和pfmdr1基因在RNA水平上的差异 59-90 前言 59-60 第一节 应用实时荧光定量PCR方法研究多种抗疟药或组合作用后Fcc SM_1/yN株pfcrt和pfmdr1基因mRNA表达水平的差异 60-83 材料和方法 60-68 结果 68-83 第二节 应用RT-PCR方法研究多种抗疟药或组合作用后Fcc SM_1/yN株pfcrt和pfmdr1基因mRNA表达水平的差异 83-86 前言 83-84 材料和方法 84-86 结果 86-90 结语 90-92 参考文献 92-97 博士期间发表的文章 97-112 恶性疟原虫对氯喹抗性及其逆转剂的研究进展 97-102 酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株Fcc SM_1/yN株对氯喹反应性的研究 102-112 致谢 112-113 原始测序报告 113-134
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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 寄生虫病 > 原虫病 > 疟疾
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