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不同类型玉米自交系胚乳发育关键时期差异表达基因的分离与克隆

作　者: 刘艳阳
导　师: 李玉玲
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 玉米胚乳抑制差减杂交基因表达电子定位基因克隆
分类号: S513
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 232次
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内容摘要

玉米胚乳占籽粒重量的80%以上,胚乳细胞的发育、增殖和充实状况决定着籽粒的重量和品质。前人对玉米籽粒胚乳的研究主要集中在籽粒淀粉的特性及其合成过程中关键酶的作用方面,对籽粒胚乳不同时期发育机理,特别是分子机理的认识还十分有限。本研究以粒重差异较大的爆裂玉米自交系N04和马齿型普通玉米自交系丹232为材料,在研究其籽粒灌浆进程的基础上,确定胚乳发育关键时期,采用抑制差减杂交技术,批量克隆了两个自交系胚乳发育关键时期差异表达的EST,并对部分EST进行了差异表达验证、电子定位和比较基因组学分析。另外,还克隆了一个GTP结合蛋白的Arf家族基因的全长cDNA序列,并分析了其在N04胚乳发育过程中的表达情况和组织特异性。研究结果不仅有助于挖掘不同类型玉米胚乳发育相关基因,揭示胚乳发育和籽粒形成的分子机理,更重要的是为粒重候选基因的挖掘、以及利用基因工程方法提高粒重和改良品质提供了新基因贮备、高水平的材料平台和理论依据。主要结果如下:1.采用Richards方程拟合小粒爆裂玉米自交系N04和大粒马齿型普通玉米自交系丹232籽粒灌浆过程,结果表明,自交系N04的起始生长势较大,最大灌浆速度较小,到达最大灌浆速度的时间较早;自交系丹232的起始生长势小,最大灌浆速度较大,到达最大灌浆速度的时间较晚,活跃生长期较长,平均灌浆速率和最大灌浆速率时的百粒重较大,说明两个自交系籽粒灌浆过程中各种代谢活动差异较大。从胚乳、胚、果皮的鲜重和干重的动态变化可以看出,授粉后10 d(10 DAP)至20 d(20 DAP)是胚乳发育的关键时期。两个自交系胚乳发育的显微结构观察发现,N04和丹232在10 DAP处于细胞分裂阶段,之后胚乳细胞内含物快速增长,20 DAP胚乳细胞充满淀粉粒。N04胚乳发育成硬质型,丹232胚乳发育成粉质型,两个自交系的胚乳结构存在较大差异。综合考虑以上研究结果,确定选取两个自交系10 DAP和20 DAP两个关键时期的胚乳进一步研究其差异表达基因。2.利用抑制差减杂交方法,分别构建了自交系N04和丹232 10 DAP和20 DAP胚乳的正反向4个抑制差减杂交库,分别富集了N04胚乳早期、N04胚乳中期、丹232胚乳早期和丹232胚乳中期增强表达的基因。对其进行反向Northern杂交验证后测序,获得902个非重复序列。用BioEdit和ClustalW软件分别进行多序列的重叠分析,共得到344个UniqueESTs,包括204个Contigs和140个Singletons。根据Blastx分析结果,去除4个差减文库之间的重复序列,共得到了160个不同的EST序列,推测其编码的蛋白质与其他物种已知蛋白质的氨基酸序列具有很高的相似性,有20%的差异表达基因为功能未知或新发现的EST。功能已知的EST涉及代谢途径的多个方面,包括20%的基础代谢、5.21%的转录及其调控(包括3.75%的转录因子)、2.6%的信号转导、3%的细胞生长和分裂、26.04%的蛋白加工和5.73%的物质运输等相关基因。3.利用电子定位和比较基因组学的方法将差异表达EST定位到玉米染色体上,并与前人定位的粒重QTL位点进行了比较分析。70条定位上的ESTs分布在玉米十条染色体上,其中第4染色体上定位的ESTs最多,占24.29%,第10染色体上定位的ESTs最少,占2.86%。9条ESTs位于已定位粒重QTL所在的标记区间,占总定位ESTs的12.9%,并分别位于第1、2、3、6、7和8染色体上。两条ESTs PE12C5和PE15C3共同定位到利用与本研究相同的两个自交系定位百粒重QTL的标记区间,推测其分别编码锌指家族蛋白和GTP结合蛋白。4.采用电子克隆结合RT-PCR的方法验证、分离克隆了一个GTP结合蛋白的全长cDNA序列。序列长938 bp,编码区609 bp,5′-非编码区有237 bp,3′-非编码区有89 bp,编码202个氨基酸的蛋白质。该蛋白质分子量为22.77 KD,等电点是6.13,前15个氨基酸为信号肽序列,具有小G蛋白Arf家族基因的结构域,同时还含有ABC转运蛋白的结构域。该基因在自交系N04胚乳发育早期表达量较高,而后逐渐降低,且无组织特异性,在根、茎、叶、胚和果皮中均表达,但存在不同组织间的调控作用差异,茎中表达较强,根中表达较弱。

全文目录

致谢  4-9
摘要  9-8
缩略词表  8-11
第一章文献综述  11-33
  1.1 玉米籽粒胚乳发育研究进展  11-19
    1.1.1 玉米胚乳细胞的分裂与增殖  11-12
    1.1.2 胚乳发育过程中的物质积累  12-16
    1.1.3 玉米胚乳突变基因的研究  16-18
    1.1.4 玉米胚乳发育的分子机理研究进展  18-19
  1.2 差异表达基因的研究方法及其应用  19-26
    1.2.1 差异表达基因的分离方法  19-23
    1.2.2 抑制差减杂交(SSH)技术  23-26
    1.2.3 抑制差减杂交(SSH)技术在玉米中的应用  26
  1.3 发掘和克隆基因的方法  26-31
    1.3.1 功能克隆  27-28
    1.3.2 PCR扩增克隆  28
    1.3.3 转座子标记法  28-29
    1.3.4 mRNA差别显示  29
    1.3.5 cDNA末端快速扩增(RACE)  29
    1.3.6 图位克隆  29-30
    1.3.7 同源性克隆基因  30
    1.3.8 电子克隆  30-31
  1.4 本研究目的与意义  31-33
第二章马齿型和爆裂型玉米自交系籽粒胚乳发育分析  33-43
  2.1 材料与方法  33-35
    2.1.1 材料和取样方法  33
    2.1.2 石蜡切片方法  33-35
    2.1.3 统计分析方法  35
  2.2 结果与分析  35-40
    2.2.1 灌浆过程中鲜重和干重的增长动态  35-37
    2.2.2 籽粒灌浆过程中胚乳、果皮、胚的鲜重和干重变化动态  37
    2.2.3 籽粒发育不同时期各部分干重占整个粒籽粒干重的比例  37-39
    2.2.4 胚乳发育显微结构分析  39-40
  2.3 讨论  40-43
第三章马齿型和爆裂型玉米自交系籽粒发育不同时期胚乳差异表达EST的分离和克隆  43-83
  3.1 材料与方法  43-57
    3.1.1 试验材料  43
    3.1.2 总RNA的提取及Poly(A)RNA的分离  43-46
    3.1.3 抑制差减杂交  46-53
    3.1.4 差减cDNA文库的差异筛选  53-55
    3.1.5 差异表达EST的序列分析  55
    3.1.6 差异表达EST的半定量RT-PCR  55-57
  3.2 结果与分析  57-76
    3.2.1 提取总RNA质量的检测  57
    3.2.2 提取mRNA的质量检测  57-58
    3.2.3 抑制差减效率分析  58
    3.2.4 不同时期籽粒胚乳差异表达EST库的构建  58-59
    3.2.5 差异表达基因片段的反向Northern验证  59-61
    3.2.6 差异表达EST的同源序列比对结果  61-69
    3.2.7 差异表达EST的功能分类  69-71
    3.2.8 差异表达EST的半定量RT-PCR验证分析  71-72
    3.2.9 胚乳不同发育时期差异表达基因的比较分析  72-74
    3.2.10 不同类型玉米自交系籽粒乳发育差异表达基因的比较分析  74-76
  3.3 讨论  76-83
    3.3.1 不同类型玉米自交系籽粒胚乳发育差异表达基因的类型及其复杂性  76-77
    3.3.2 胚乳发育进程与差异表达基因的关系  77
    3.3.3 不同类型玉米自交系籽粒胚乳发育差异表达基因涉及的生理功能  77-80
    3.3.4 EST技术是研究玉米胚乳发育的有力工具  80-83
第四章差异表达EST的电子定位及比较基因组学定位粒重QTL的分析  83-91
  4.1 材料与方法  83-84
    4.1.1 玉米ESTs来源  83
    4.1.2 玉米QTL定位信息的收集  83
    4.1.3 定位方法  83-84
  4.2 结果与分析  84-86
    4.2.1 差异表达ESTs的电子定位  84
    4.2.2 ESTs定位结果与粒重QTL的整合  84-86
  4.3 讨论  86-91
第五章基于电子延伸技术的玉米小G蛋白ZmArf2基因全长cDNA克隆及表达分析  91-103
  5.1 材料与方法  91-92
    5.1.1 实验材料  91
    5.1.2 试验方法  91-92
  5.2 结果与分析  92-100
    5.2.1 ZmArf2基因的拼接、克隆、测序及序列分析  92-97
      5.2.1.1 ZmArf2基因的拼接、扩增及克隆测序  92-97
    5.2.2 玉米ZmArf2与其它物种的Arf基因编码蛋白质的氨基酸序列比较  97-99
    5.2.3 ZmArf2在胚乳发育过程中的表达分析  99
    5.2.4 ZmArf2基因组织特异性表达分析  99-100
  5.3 讨论  100-103
    5.3.1 关于电子拼接技术  100
    5.3.2 关于Arf基因  100-103
参考文献  103-115
ABSTRACT  115-119
作者简历  119

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