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应用系统代谢工程方法改进产核黄素枯草芽孢杆菌的研究

作　者: 史硕博
导　师: 赵学明
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 代谢工程枯草芽孢杆菌核黄素嘌呤途径改造转录组 PRPP浓度平衡前体物供给
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文系统分析了三株不同核黄素产量B. subtilis工程菌株的代谢特征,揭示了菌株产核黄素的内在遗传机理,同时构建了一系列产核黄素B. subtilis基因工程菌,得到的主要结果如下:发现purF基因采用不同的整合方式对菌体代谢的影响有明显差异,原因在于采用双交换整合机理构建的系列工程菌中仅purF基因表达水平提高;而采用单交换整合机理构建的系列工程菌中不仅purF基因而且其下游purM、purN、purH、purD基因的表达水平皆有不同程度的提高,这些基因的编码产物可催化更多的嘌呤前体物谷氨酰胺、甘氨酸、10-甲醛四氢叶酸(10-Formyl-THF)进入嘌呤途径,故其对菌体代谢影响较大。从基因表达水平上揭示产核黄素工程菌的主要特点,确定了产核黄素菌株应具有的有利表型:表达增强显著的核黄素操纵子,将加强核黄素合成途径;citZ基因及副产物形成有关的基因的下调,可避免溢流代谢、减少副产物生成;采取谷氨酸脱氢酶催化的途径利用氮源(NH4+)能节约菌的能量消耗;葡萄酸支路可提供充足的核黄素合成起始物5-磷酸核酮糖;采用能量耦合效率高的aa3氧化酶来产生能量,可有效改善能量供给。以工程菌RH33和RH44为亲株,增强表达PRPP合成酶及核糖-5-磷酸异构酶可提高胞内PRPP浓度,促进PurR调控基因的表达,进而促使胞内更多的嘌呤核苷酸、谷氨酰胺、一碳单位、甘氨酸、二氧化碳和天冬氨酸等核黄素前体物合成途径加强并参与到核黄素合成途径,核黄素合成能力分别提高20%和3.4%。核黄素合成过程中,需要1分子的DARPP(长途径提供)和2分子的DHPB(短途径提供)生成1分子的核黄素。增加PRPP浓度虽然一方面加强了前体物的供给,另一方面解除了对嘌呤及甘氨酸合成途径等PurR调控基因的抑制,但这两方面作用仅仅在于提高GTP合成途径(长途径)的通量,没有缓解存在的前体物供给不平衡,RH44对此尤为敏感。为平衡前体物供给以提高核黄素生产,在RH44中增强表达3,4-二羟基磷酸丁酮(DHPB)合成酶以增加DHPB供给,缓解存在的前体物供给不平衡,从而构建RH44-RB。RH44-RB与其亲株RH44相比,菌体生长变慢,糖耗减少,核黄素产量在摇瓶培养下达到6.0 g/l,产率达到0.061(g riboflavin/g glucose),与出发菌RH44相比分别提高了17%和19%。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-11
第一章文献综述  11-40
  1.1 核黄素的理化性质、功能和用途  11-12
  1.2 核黄素的主要生产工艺  12-13
  1.3 Bacillus subtilis中核黄素生物合成途径及其代谢调节机制  13-21
    1.3.1 核黄素生物合成及调控相关基因  13-16
    1.3.2 前体物GTP的合成以及代谢调节机制  16-20
    1.3.3 前体物5-磷酸核酮糖的合成以及代谢调节机制  20-21
  1.4 产核黄素Bacillus subtilis工程菌的构建和策略  21-27
    1.4.1 代谢模型的建立与模拟  22-23
    1.4.2 传统诱变及基因组重排技术  23-24
    1.4.3 增加核黄素操纵子的转录和表达  24-25
    1.4.4 增加前体物的供给或减少副产物形成  25-26
    1.4.5 其它相关途径的改造  26-27
  1.5 系统生物学在代谢工程中的应用——系统代谢工程  27-28
  1.6 系统代谢工程的有力工具-转录组学  28-37
    1.6.1 转录组技术平台  29-34
    1.6.2 转录组在代谢工程领域的应用  34-37
  1.7 本文主要技术路线  37-40
    1.7.1 选题背景  37-38
    1.7.2 技术路线与研究内容  38-40
第二章嘌呤代谢对产核黄素枯草芽孢杆菌的影响  40-73
  2.1 实验材料  41-46
    2.1.1 质粒与菌株  41-42
    2.1.2 主要仪器  42
    2.1.3 主要试剂  42-44
    2.1.4 培养基  44-45
    2.1.5 主要溶液  45-46
  2.2 实验方法  46-56
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  46-47
    2.2.2 大肠杆菌质粒的提取  47
    2.2.3 DNA片段的回收纯化  47-48
    2.2.4 PCR反应体系  48-49
    2.2.5 酶切体系  49
    2.2.6 内切酶的失活  49
    2.2.7 连接体系的建立  49-50
    2.2.8 DNA 3’凹端的补平  50
    2.2.9 琼脂糖凝胶电泳  50
    2.2.10 枯草芽孢杆菌Spizzen转化  50
    2.2.11 枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取  50-51
    2.2.12 菌体生长曲线的测定  51
    2.2.13 发酵和测定样品中各物质的含量  51-52
    2.2.14 枯草芽孢杆菌总RNA的提取  52
    2.2.15 枯草芽孢杆菌总RNA的分析和定量  52-53
    2.2.16 枯草芽孢杆菌总RNA中基因组DNA的去除  53
    2.2.17 Real-time RT-PCR操作过程  53
    2.2.18 高氯酸法提取胞内物质  53-54
    2.2.19 胞内核苷酸的测定  54
    2.2.20 酶液的制备  54
    2.2.21 蛋白质含量的测定--Bradford法  54-55
    2.2.22 谷氨酰胺PRPP转酰胺酶酶活测定  55
    2.2.23 引物  55-56
  2.3 实验结果与讨论  56-71
    2.3.1 purF基因双交换整合扩增方式质粒pDGFS的构建  56-58
    2.3.2 purF基因双交换整合方式构建产核黄素基因工程菌  58-60
    2.3.3 双交换整合方式构建基因工程菌生理参数对照  60-63
    2.3.4 purF基因单交换整合扩增方式质粒pUCF24 的构建  63-66
    2.3.5 purF基因单交换整合方式构建产核黄素基因工程菌  66-68
    2.3.6 单交换整合方式构建基因工程菌生理参数对照  68-71
    2.3.7 单交换整合方式构建基因工程菌核黄素产量对照  71
  2.4 本章小结  71-73
第三章核黄素高产工程菌的系统分析和目标靶点预测  73-98
  3.1 实验材料  74-76
    3.1.1 菌株  74
    3.1.2 实验仪器  74
    3.1.3 实验试剂  74-75
    3.1.4 主要软件  75
    3.1.5 培养基  75
    3.1.6 主要溶液  75-76
  3.2 实验方法  76-80
    3.2.1 菌株培养与取样  76
    3.2.2 RNA提取及纯化  76-77
    3.2.3 RNA质量检查  77-78
    3.2.4 mRNA样品的反转录、cDNA的片段化及标记  78-79
    3.2.5 基因芯片的杂交、清洗、染色和扫描  79-80
    3.2.6 芯片数据分析方法  80
    3.2.7 RT-PCR验证表达谱结果  80
    3.2.8 胞内代谢物浓度的测定  80
  3.3 实验结果与讨论  80-96
    3.3.1 取样点的确定  80-81
    3.3.2 RNA的提取、检测、定量  81-82
    3.3.3 基因芯片杂交及结果  82-83
    3.3.4 差异表达基因的确定  83-84
    3.3.5 RT-PCR验证  84-85
    3.3.6 差异表达基因功能分析  85-87
    3.3.7 分析产核黄素工程菌全基因组表达谱  87-96
  3.4 本章小结  96-98
第四章胞内PRPP浓度增加对核黄素高产工程菌的影响  98-116
  4.1 实验材料  99-101
    4.1.1 菌株  99-100
    4.1.2 实验仪器  100
    4.1.3 实验试剂  100
    4.1.4 培养基  100
    4.1.5 主要溶液  100-101
  4.2 实验方法  101-102
    4.2.1 PRPP合成酶酶活测定  101
    4.2.2 核糖-5-磷酸异构酶酶活测定  101-102
    4.2.3 胞内核糖-5-磷酸测定  102
    4.2.4 流加发酵  102
  4.3 实验结果与讨论  102-115
    4.3.1 表达PRPP合成酶载体的构建  102-107
    4.3.2 增强表达 PRPP 合成酶的菌株构建  107
    4.3.3 增强表达 PRPP 合成酶菌株生理参数表征  107-108
    4.3.4 构建同时表达PRPP合成酶及核糖-5-磷酸异构酶的载体  108-110
    4.3.5 同时增强表达PRPP合成酶及核糖-5-磷酸异构酶菌株构建  110-111
    4.3.6 同时增强表达PRPP合成酶及核糖-5-磷酸异构酶菌株生理表征  111-113
    4.3.7 胞内PRPP浓度增加对工程菌核黄素产量影响  113-115
  4.4 本章小结  115-116
第五章前体物平衡供给对产核黄素的影响  116-127
  5.1 实验材料  117-118
    5.1.1 菌株与质粒  117
    5.1.2 主要仪器  117-118
    5.1.3 主要试剂  118
    5.1.4 培养基  118
    5.1.5 主要溶液  118
  5.2 实验方法  118-119
    5.2.1 3,4-二羟基磷酸丁酮合成酶酶活测定  118
    5.2.2 三磷酸鸟苷（GTP）环水解酶II酶活测定  118-119
  5.3 实验结果与讨论  119-126
    5.3.1 B. subtilis 3,4-二羟基磷酸丁酮合成酶编码区的相似性分析  119-120
    5.3.2 含大肠杆菌ribB基因质粒的构建  120-122
    5.3.3 增强表达3,4-二羟基磷酸丁酮合成酶菌株构建  122-123
    5.3.4 增强表达3,4-二羟基磷酸丁酮合成酶菌株生理参数及核黄素产量表征  123-126
  5.4 本章小结  126-127
第六章结论与展望  127-130
  6.1 结论和创新点  127-129
    6.1.1 主要结论  127-128
    6.1.2 创新点  128-129
  6.2 展望  129-130
参考文献  130-146
附录  146-157
发表论文和科研情况说明  157-159
致谢  159

应用系统代谢工程方法改进产核黄素枯草芽孢杆菌的研究

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