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谷氨酰胺对脂多糖致大鼠心功能障碍的保护作用研究

作　者: 黄日红
导　师: 曲鹏
学　校: 大连医科大学
专　业: 内科学
关键词: 脂多糖谷氨酰胺 Toll样受体心肌凋亡心肌保护
分类号: R631
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：脓毒症早期即存在心血管功能异常,尤其是严重脓毒症和脓毒症休克患者,有50%存在左室收缩／舒张功能异常。关于脓毒症继发心功能障碍的机制复杂多样,主要与细菌内毒素(主要成分为脂多糖LPS)激活血管内皮、中性粒细胞、单核巨噬细胞系统,进而激活凝血、补体激肽系统等,释放多种炎症介质和细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1 p(IL-1 p)、溶酶体、一氧化氮(NO)等有关,这些心肌抑制因子(MDS)可以直接损伤心肌细胞,同时亦影响心肌线粒体、内质网代谢功能。此外脓毒症时心肌细胞钙循环障碍以及TNF-α诱导的心肌细胞凋亡等也促进了心功能障碍的发生。涉及面甚广,难以从单一环节阻断。Toll样受体(TLR)能够识别病原体,并在病原体入侵机体的早期启动天然免疫,促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答,LPS激活TLR4的信号转导通路后导致NF-K B激活,使炎症因子大量表达,导致全身炎症反应和多器官功能衰竭的发生。A20作为一种NF-κB依赖性表达的胞质蛋白,对NF-κB活性有负反馈调控作用,参与了体内炎症反应的调节和凋亡抑制。所以通过屏蔽TLR4或下调TLR4表达以阻断感染的源头;同时促进A20表达,抑制LPS信号转导,成为近年来防治感染继发心功能障碍研究的热点。谷胺酰胺(Glutamine, Gln)作为体内最丰富的游离氨基酸,能够通过诱导GSH合成及热休克蛋白70表达以增强抗氧化物质活性、抑制NO的产生,是一种多靶点的心肌保护药物。因此,Gln已经作为心肌缺血再灌注损伤保护剂及危重症患者肠粘膜免疫屏障保护剂应用于临床,甚至可以改善Sepsis患者的预后,证实该药是安全可靠的。鉴于已有研究证实：Gln可以下调sepsis大鼠肠道粘膜TLR4信号通路表达,从而减轻肠粘膜损伤；Gin还可以减少I-κB的分解,抑制NF-κB的激活使促炎性细胞因子水平降低。简言之,Gln可以在上游TLR4表达和下游NF-κB激活双环节抑制TLR4信号传导,从而减轻炎性损伤。同时戚仁斌等应用Gin进行大鼠离体心脏主动脉逆灌流,对LPS损伤引起的心肌细胞单相动作电位幅度减小、MAPD及MAPD20延长、心肌张力降低、心率变慢等变化有明显的改善作用,说明Gin对LPS所致心肌损伤有一定保护作用。因此我们通过应用LPS血症大鼠模型,观察作为抗氧化、免疫营养调理制剂应用的Gin能否通过抑制TLR4-NF-κB信号通路,抑制LPS信号转导,减轻心肌损伤及心肌凋亡而保护心功能,以期为防治感染继发心功能障碍提供有效辅助治疗药物。方法：1.动物模型制备和实验分组：健康清洁级SD大鼠90只,雄性,体质量(350±25)g随机分为为3组：对照组10只：生理盐水5ml／只；LPS组40只：LPS10mg/、kg(以生理盐水稀释至5m1):LPS+Gln组40只：LPS 1 Omg/kg+Gln 1 g/kg(以生理盐水稀释至5ml)腹腔注射。于注药后6、24、48、72h处死动物。2.腹腔注药后6、24、48、72h后右颈总动脉插管至左心室,RM6240BD多功能生理记录仪测定平均血压(MAP)、左室收缩末期压力(LVESP).左室压力上升及下降最大变化速率(士dp/dtmax)等心功能指标。3.心尖组织固定、脱水、包埋,HE染色,观察心肌病理学变化。4.RT-PCR检测心肌TLR4.A20.TNF-αmRNA表达,Western-blotting法检测TLR4.A20.NF-κB p65蛋白表达。5.RT-PCR检测心肌Bax.Bcl-2 mRNA表达,免疫组化方法测定心肌Bax.Bcl-2蛋白表达;TUNEL检测心肌细胞凋亡水平；比色法测定Caspase-3活性。6.ELISA测定心肌TNF-α、血清CTnI.NT-ProBNP含量。结果：1.大鼠毒血症表现：大鼠注射LPS 6h后即出现倦怠、嗜睡,进食进水明显减少,呼吸急促,松毛,眼鼻血性分泌物,腹泻,体重下降。解剖见心脏扩大、双肺淤血。2.心功能测定：与对照组比较,LPS注射6h后即先后出现大鼠心脏+dp/dtmax.-dp/dtmax下降,且呈进行性下降趋势,至72h回升。Gln可使不同时间点LVESP.+dp/dtmax.一dp/dtmax升高(P<0.05)。3.病理检查：LPS组大鼠心肌细胞水肿、变性坏死,Gln治疗组心肌细胞损伤减轻。5.LPS组心肌组织TLR4.A20.TNF-αmRNA及TLR4.A20.NF-κBp65蛋白表达升高,LPS+Gln24h组较LPS24h组有下降趋势,差异显著(P<0.05)。6.LPS导致心肌Bcl-2/Bax下降；Caspase一3活性及凋亡率明显升高；Gln可提升心肌Bcl-2／Bax,降低Caspase-3活性及凋亡率(P<0.05)。7.LPS组心肌TNF-α、血清CTnI.BNP浓度显著升高, Gln能降低TNF-α.CTnI.NT-proBNP浓度,使TNF-α提前降至正常。(P<0.05)。结论：1.LPS通过TLR4信号转导通路诱导炎症介质表达和心肌细胞凋亡等,导致心肌损伤及心功能障碍。2. Gln能抑制TLR4-NF-κB信号转导通路,对LPS致心肌损伤具有一定保护作用。3. Gln可部分抑制LPS致心肌凋亡作用,并部分改善心功能。4. A20基因表达上调系NF-κB自身调节所致,Gln无上调A20基因表达作用。

全文目录

一、摘要  6-13
  (一) 中文摘要  6-9
  (二) 英文摘要  9-13
二、文献综述  13-25
  (一) 综述  13-22
  (二) 参考文献  22-25
三、正文  25-70
  第一部分  25-46
    前言  25-26
    材料和方法  26-33
    结果  33-40
    讨论  40-43
    结论  43-44
    参考文献  44-46
  第二部分  46-60
    前言  46-47
    材料和方法  47
    结果  47-55
    讨论  55-57
    结论  57-58
    参考文献  58-60
  第三部分  60-70
    前言  60
    材料和方法  60-61
    结果  61-65
    讨论  65-67
    结论  67-68
    参考文献  68-70
四、致谢  70-71

谷氨酰胺对脂多糖致大鼠心功能障碍的保护作用研究

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