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燕窝DNA基原鉴定及抗病毒作用研究

作　者: 林洁茹
导　师: 赖小平
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 燕窝 Cytb基因 DNA序列分析抗流感病毒作用
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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引　用: 2次
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内容摘要

目的：燕窝为雨燕科金丝燕属(Aerodramus或Collocalia)多种鸟类分泌唾液筑成的巢窝,主产于东南亚。燕窝药食皆宜,因资源有限而价格日渐攀升,引致商品屡有伪劣掺杂现象。传统上燕窝的商品价值,还与其生物基原和产地密切相关,需在燕窝鉴定时有所辨别。但是,目前的燕窝质量检验方法,均无法鉴定燕窝的生物基原和产地。例如紫外分光光度、红外光谱法、气相色谱法、蛋白质电泳、化学成分含量测定等,主要通过检测燕窝与各种伪掺品在化学成分上的差异,鉴别燕窝的真伪或纯净度。近年来,基于分子生物学技术的基因研究,成为物种鉴定的一个重要手段。因此,利用分子生物学技术从基因角度鉴定燕窝的生物基原将有可能为燕窝质量检验难题带来突破,并对现有的检验手段提供重要补充。此外,学术界对燕窝的功效,以及其市场售价是否反映其功效一直存有疑问。针对上述问题,本文探讨了DNA序列分析技术在燕窝基原鉴定上的应用,以期通过基原鉴定评价燕窝质量。同时,也对燕窝抗流感病毒的药理作用和机理进行了研究,以期为燕窝建立一种药效评价模型,为燕窝的药效研究、以及燕窝质量与功效的相关性研究奠定基础。方法和结果：1.燕窝的基原鉴定研究采用DNA序列分析技术鉴定燕窝的基原,研究内容依次包括以下三方面：高质量DNA的提取、目标基因的扩增和序列测定、目标基因的序列分析。在DNA提取研究方面,本文考察了试剂盒法、碱裂解法、苯酚法、高盐低pH法提取燕窝DNA的效果,结果显示仅苯酚法可提取到DNA。进一步优化苯酚法的裂解液配方、纯化方法、沉淀条件,最终确定燕窝DNA的提取方法为：首先使用含高浓度NaCl的SDS缓冲液溶解燕窝蛋白并裂解混入其中的细胞,溶解后的燕窝蛋白在高盐溶液中逐渐析出沉淀,从而可通过离心与DNA分离；接着用氯仿异戊醇混合液萃取DNA溶液,使残留的糖蛋白变性沉淀而去除；然后加入CTAB并用氯仿异戊醇混合液萃取,此时DNA溶液仍处于高盐状态,利用CTAB可在高盐下与DNA形成可溶性复合物而与多糖形成沉淀的特性,进一步去除残留的糖蛋白；最后用预冷的异丙醇在室温下对DNA进行短时间的沉淀,以减少糖蛋白和DNA共沉淀。以上DNA提取方法可克服燕窝蛋白对DNA提取的干扰,从燕窝中获得适合进行PCR扩增的DNA进行后续研究。在扩增DNA前,需选择待研究的目标基因。通过搜索NCBI核酸数据库,发现目前有20种Aerodramus属和10种Collocalia属的金丝燕提交了Cytb基因的部分或全部序列,共82条,是金丝燕属物种中提交序列数最多的基因片段。Cytb基因具有较快的进化速度,已广泛用于研究鸟类的种间遗传差异。因此,我们选择Cytb基因作为目标基因进行序列分析,希望可反映不同种属、不同地域金丝燕的基因差异,从而鉴定燕窝的基原。从生物样品中提取得到的微量基因,一般需扩增后方可进行序列测定。然而,从燕窝中提取的DNA,由于丰度低和糖蛋白污染,PCR成功率和灵敏度很低。为此,本研究考察了提高PCR成功率和灵敏度的方法,包括：增加PCR缓冲液的Mg2+浓度、使用PCR增强剂、采用增效PCR、进行二次PCR、小反应体系PCR、降低退火温度、巢式PCR。研究结果显示仅巢式PCR技术可显著提高燕窝DNA的PCR成功率和灵敏度。此外,因巢式PCR使用了2对特异性引物进行扩增,目标基因需与2对引物均可结合才能被扩增,故巢式PCR还可同时提高扩增的特异性,避免外源性DNA污染对结果的干扰。本研究确定的巢式PCR方法是：先用引物ND5和Thr扩增Cytb全序列,再以此产物为模板,选择4个内部引物分别扩增出Cytb基因的左、中、右三个片段。对这三个片段进行测序并比较其序列测定信号、扩增成功率及信息位点含量以选择适用于序列分析的片段。结果发现中间片段测序信号清晰,杂峰干扰少,扩增和测序成功率高,简约信息位点高于其他片段,故选择中间片段进行序列分析以鉴定燕窝基原。本研究通过建立进化树进行目标基因的序列分析。首先在Genbank上对样品序列进行BLAST搜索获取最相似序列,并计算这些序列与样品序列之间的相似度,初步确定样品的来源。随后下载待检样品的相似序列,并以蜂鸟的Cytb序列作为外群构建进化树。因BLAST搜索结果显示所有待检样品前100条相似序列均来源于金丝燕属(Aerodramus)或雨燕属(Apus)物种,故下载所有金丝燕属(Aerodramus)和雨燕属(Apus)物种的Cytb序列构建进化树。本文共研究了14种样品,包括：11种印度尼西亚燕窝、1只从印度尼西亚燕窝产地捕获的产燕窝的金丝燕标本、1种即食燕窝,1种广东省怀集县产的燕窝。为提高基原鉴定结论的可信度,本研究采用了三种不同的建树方法,即邻接法、最大简约法和Baysian分析法,分别构建了三棵进化树。结果显示,三种建树方法得到的进化树均将所有样品的序列聚为两组：金丝燕属和雨燕属。印度尼西亚燕窝样品、即食燕窝样品和金丝燕标本在三个进化树中均聚类于金丝燕属,与爪哇金丝燕(A erodramus fuciphaga)最接近,可认定爪哇金丝燕为这些样品的生物来源。三个进化树中,怀集燕窝均聚类于雨燕属,邻接树与Bayesian树显示其与白腰雨燕(Apus affinis)和小白腰雨燕(Apus nipalensis)最接近,但无法分辨属于两者中的哪一种,最大简约树则显示其与小白腰雨燕(Apus nipalensis)更接近。白腰雨燕和小白腰雨燕亲缘关系相近,后者是前者在东部亚洲的亚种,中国的标本命名为Apus affinis subfurcatus.依据进化树的结果,结合地缘关系分析,可推断怀集燕窝的生物来源为小白腰雨燕(Apus nipalensis)。2.燕窝的抗病毒作用研究中医认为,燕窝具有润肺滋阴、化痰止咳、益气补中的功效。现代药理研究显示其主要药理作用是抗病毒、促细胞分裂和免疫促进。燕窝的抗病毒作用可能与燕窝临床用于治疗呼吸道和消化道疾病相关,而该作用与其所含的唾液酸蛋白有关。因此燕窝抗病毒作用对于阐明其功效的科学机制、产品研发和代用品研究均具有重要意义,本研究故此选择基于唾液酸的燕窝抗病毒作用探讨其药效。本研究选择体外抗病毒模型对燕窝抗病毒作用进行初步研究,考虑到燕窝的传统用法是水炖煮后口服,胃肠道内的酸碱和酶环境可能引起燕窝蛋白成分的水解,并进而可能影响其活性,所以研究分成两个部分进行,第一部分为样品的制备研究,第二部分为体外抗病毒作用的初步评价。样品制备需模拟燕窝水炖煮时及口服进入胃肠道后所经历的处置过程。因此采用了三种方法制备用于抗病毒实验的燕窝样品：1.燕窝水提取物：80℃水提1h。2.燕窝水提取物的人工胃液消化物：燕窝水提物中加入等体积的2×人工胃液,37℃保温10 min。3.燕窝水提取物人工肠液消化物：燕窝水提物中加入等体积的2×人工肠液,37℃保温10 min。对上述三种样品采用SDS聚酰胺凝胶电泳检测其降解程度,结果显示,未经人工胃液或人工肠液处理的燕窝样品,其蛋白质分子量大部分集中在170KDa附近,加入人工胃液或人工肠液处理1 min后蛋白质即发生明显降解,降解产物主要仍为大分子蛋白质,但分子量多在55～100 KDa。说明燕窝口服时在消化道的处理过程会使其化学成分降解。对燕窝抗病毒作用的初步研究采用体外试验,检测上述三种燕窝提取物对H5N1禽流感假病毒活性的影响、对VSV-G假病毒活性的影响、对H5、H7、H9型阳性抗原凝血作用的影响、以及对N1型神经氨酸酶活性的影响。结果显示,三种燕窝提取物均对H5N1禽流感假病毒的活性有抑制作用,抑制作用的强度随燕窝提取物浓度增高而增加。其中人工肠液消化物的作用最强,半数有效浓度(IC50)为2.30+0.62,人工胃液消化物的作用次之(IC50为4.00a：3.60),水提取物最弱(IC50为5.29+1.79)。为了进一步研究燕窝对H5N1禽流感假病毒的抑制作用机理,检测了三种燕窝提取物对VSV-G假病毒活性的影响,结果显示三种燕窝提取物均对VSV-G假病毒没有抑制作用。由于H5N1假病毒和VSV-G假病毒两者间仅包膜蛋白存在差异,燕窝提取物对前者有抑制作用,而对后者却无,说明该抑制作用的靶点为H5N1禽流感假病毒的包膜蛋白。H5N1禽流感病毒的包膜蛋白上有两种与其感染主宿主功能相关的重要蛋白,即H5型的血凝素(HA)和N1型的神经氨酸酶(NA),为了研究燕窝提取物通过哪一种蛋白起作用,本实验分别检测了燕窝提取物对禽流感病毒的H5、H7和H9三种类型阳性抗原的血凝作用的影响,以及其对NA的直接抑制作用。结果显示,三种燕窝提取物除了对H5型阳性抗原的血凝有抑制作用外,对H7和H9两型阳性抗原的血凝也有抑制作用,但均对NA没有抑制作用,说明燕窝提取物可以影响HA的功能,提示燕窝提取物抗病毒的作用可能通过抑制包膜蛋白上血凝素的活性而实现,即血凝素可能是燕窝提取物抗病毒的作用靶点。结论：燕窝的基原鉴定在国内外尚属空白。本研究利用DNA测序技术和进化树分析,基于线粒体上的cytb基因,首次建立了适用于燕窝药材和即食燕窝制品的燕窝基原鉴定的方法。本方法从基因角度鉴定实验中所收集的印尼燕窝和怀集燕窝基原分别为爪哇金丝燕(Aerodramus fuciphaga)和小白腰雨燕(Apus nipalensis)。通过DNA技术进行燕窝基原鉴定的主要技术难点是：燕窝DNA的低丰度、严重的糖蛋白干扰和外源性DNA污染难以剔除。本研究通过优化DNA提取技术消除了大部分糖蛋白的干扰,通过使用巢式PCR技术提高了PCR扩增的灵敏度和特异性,克服了以上技术难题,并通过构建多种进化树验证了结果的可靠性。本方法操作简单、费用低廉、结果稳定、重现性好。随着DNA测序技术日渐普及化,应用前景将更趋广阔。在燕窝功效方面,本研究探讨了燕窝的抗病毒作用。首次初步证明燕窝水提取物及其经人工胃液、人工肠液处理的水解产物,可抑制H5N1禽流感病毒的感染力,及流感病毒的H5、H7和H9型阳性抗原引起的血凝反应,燕窝抗病毒作用的靶点是流感病毒包膜蛋白上的血凝素。因前人研究证明不同生产环境的燕窝(洞燕和屋燕)抗病毒作用的强度不同,洞燕的抗病毒作用远高于屋燕。而荧光HPLC图谱发现,屋燕中的O-乙酰基唾液酸峰大大高于洞燕。因唾液酸结构可影响燕窝蛋白与病毒表面唾液酸受体的结合能力,故可假设洞燕与屋燕抗病毒活性的差异可能与两者唾液酸种类有关。这一研究揭示了燕窝基原鉴定的重要性。因此,燕窝抗病毒作用可用于评价燕窝的药效学,并可结合DNA基原鉴定技术,评价燕窝商品售价与药效的相关性。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-16
引言  16-18
第一部分文献综述  18-40
  1.燕窝药源和产地的记载和研究  18-22
  2.燕窝的商品市场现状  22
  3.燕窝鉴定研究  22-29
  4.燕窝的化学成分研究  29-33
  5.燕窝的功效研究  33-37
  6.研究展望和研究思路  37-40
第二部分研究内容  40-98
  第一节燕窝DNA基原鉴定  40-80
    一.燕窝DNA提取方法研究  41-56
    二.燕窝DNA的PCR方法研究及序列测定  56-69
    三.燕窝Cytb基因扩增产物的序列分析  69-80
  第二节燕窝抗病毒作用研究  80-98
    一.抗病毒实验燕窝样品的制备和研究  81-86
    二.燕窝提取物对H5N1禽流感病毒的作用及机理研究  86-98
结语  98-100
参考文献  100-106
附录一译著(与本文有关背景材料节选)  106-114
附录二发表论文一  114-124
附录二发表论文二  124-134
论文、著作及学术报告  134-136
致谢  136-137

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