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胚胎干细胞与蚕丝—胶原支架促进肌腱再生的研究

作　者: 陈晓
导　师: 欧阳宏伟
学　校: 浙江大学
专　业: 临床医学
关键词: 肌腱/韧带组织工程肌键分化，胚胎干细胞，间充质干细胞网状蚕丝支架，胶原，转基因 scleraxis 周期性力学刺激
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

中文摘要背景：随着国民素质的提高以及人们对健康的追求,体育锻炼和竞赛活动明显增加,以及由于意外事故不断发生和社会老龄化趋势日益明显,运动损伤也越来越多,其中韧带肌腱损伤占50%以上。统计表明,每年至少有3000万的肌腱损伤病例。目前,临床上对肌腱损伤的治疗主要停留在理疗、手术缝合以及自体或异体移植阶段,虽有一定效果,但是疗效有限,即使是自体肌腱移植修复也只能达到正常肌腱力学性能的40%左右,且伴随有大量疤痕组织增生。这主要是因为成体肌腱不具备完全再生能力,所以修复后肌腱的质量远不如正常肌腱,易出现肌腱粘连,肌腱结构和力学性能低下,常重复断裂。因此,寻找新型的、可促进肌腱生理性再生修复的方法具有极其重要的临床意义。随着最近10年组织工程和干细胞研究的兴起,使临床医学步入了“再生医学”的新阶段。通过利用干细胞复合支架材料的组织工程手段,促使身体自主再生已损伤组织,为提高肌腱等软组织的修复质量带来了全新的机会。肌腱组织工程技术中包含三个重要的迫切需要解决的关键问题：1)获得足够分化成熟的肌腱种子细胞；2)能够提供足够生长空间的生物支架材料；3)种子细胞分化的力学刺激以及其他转录因子的调控。然而,目前这些问题尚未解决,影响了肌腱组织工程的发展,从而制约了组织工程肌腱在临床用于肌腱缺损再生修复治疗。本研究针对目前这些现状,旨在系统的研究组织工程肌腱所面临的三个迫切问题,最终目的为复合诱导后的胚胎干细胞与蚕丝-胶原海绵支架构建组织工程肌腱并促进肌腱损伤的再生。研究内容包含：在种子细胞选择、分化和调控方面,拟采用分子生物学手段调控诱导人胚胎干细胞阶段性向肌腱细胞分化以提供足够的种子细胞,并阐明力学和转录因子因素调控干细胞肌腱分化的机理和协同效果,获得有效的肌腱分化条件；本方向的进一步研究将为肌腱分化及再生提供全新的思路和知识,为认知肌腱再生的生物机理提供实验基础和理论数据,为运用特定分化后肌腱干细胞用于肌腱再生打下基础。在组织工程支架方面,拟研发一个既符合组织工程支架需要,又具有生理承载功能的可抗拉力的功能性肌腱支架--蚕丝-胶原海绵复合支架,使之更符合肌腱生物学特性和力学特性。最终将利用研发的支架复合诱导的人胚胎干细胞,构建组织工程肌腱,通过动物模型评估组织工程肌腱对肌腱损伤修复的再生作用。本研究课题,将最终为组织工程肌腱应用于临床打下基础,为肌腱损伤治疗带来新的方向。由于肌腱与韧带在结构与功能上类似,因此,在本课题中肌腱组织工程泛指肌腱与韧带组织工程。本研究分为四个部分：(1)人胚胎干细胞(hESCs)诱导成为间质干细胞(MSCs),并应用于肌腱组织工程研究,探索hESCs促进肌腱再生的可行性和功效性；(2)研究肌腱发育特征转录因子SCX对hESCs来源MSCs的肌腱分化影响。阐明SCX对hESC-MSCs的肌腱分化调控,并获得SCX+的肌腱祖细胞。在获得SCX+肌腱祖细胞的基础上研究外加力学刺激与转录因子对肌腱分化的协同效应以及对相关信号通路的协同调控机理,明确肌腱祖细胞向肌腱分化调控机制；(3)构建网状蚕丝-胶原海绵复合支架,评估该支架用于肌腱／韧带组织工程的可行性与优势。(4)支架复合诱导后的胚胎干细胞构建组织工程肌腱,在动物模型中评估工程化的细胞与支架构成的组织工程肌腱对肌腱损伤修复的促进作用。第一章人胚胎干细胞的阶段性分化通过分泌胚胎肌腱基质和分化因子促进肌腱再生目的：人胚胎干细胞(hESCs)是组织再生的理想种子细胞,但是至今尚未有研究报道人胚胎干细胞用于肌腱再生的可能性。本课题主要研究人胚胎干细胞用于肌腱再生的策略和功效,以及相关的机理。方法与结果：首先,将人胚胎干细胞诱导分化成间充质干细胞(MSC),这种MSC具有三系分化潜能并且表达MSC的表面标记。通过肌腱特异性基因的表达和肌腱结构鉴定证明人胚胎干细胞来源的间充质干细胞(hESC-MSCs)不仅在体外组织工程模型还是在体内异位肌腱再生模型中都可以再生肌腱组织。在大鼠原位髌腱修复实验中,用hESC-MSCs处理组与对照组相比具有较好的组织结构和力学性能。另外,hESC-MSCs可以在肌腱损伤区域存活至少4周,并且分泌人胚胎肌腱特异的胞外基质成分和分化因子,这些因子进一步激活肌腱内源的再生过程。并且,在所有样本中均未发现畸胎瘤形成。结论：本研究开创了一种安全有效的将胚胎干细胞用于肌腱再生的方法,并有助于发展未来应对肌腱疾病的手段。第二章转录因子scleraxis与力学刺激协同调控干细胞腱系分化机理和效应研究目的：缺乏肌腱分化调控知识是实现肌腱再生的根本性难题。发育生物学是分化研究的线索。已有肌腱发育分化研究发现：1)SCX是肌腱祖细胞的标志,TGF, FGF是肌腱发育的关键通路,而目前从SCX+祖细胞到肌腱的分化调控知识缺乏；2)SCX是肌腱发育的必要但不充分条件,敲除SCX出现严重的肌腱缺失；3)肌腱发育过程提示存在力学刺激促肌腱成熟现象。而力学与SCX在肌腱成熟和分化中的协同作用及相应机制仍未清楚。本章主要研究SCX+祖细胞向成熟肌腱细胞分化调控机制,即以SCX+干细胞为起点复合力学刺激诱导肌腱分化,明确SCX与力学刺激对肌腱分化是否有协同作用并探索其机制。方法与结果：第一阶段将肌腱发育特征转录因子SCX转入hESC来源MSCs,获得SCX+的肌腱祖细胞。第二阶段将在SCX+肌腱祖细胞构建的细胞片的基础上研究外加周期性力学刺激(1Hz),并揭示力学与转录因子对肌腱分化的协同效应以及对相关信号通路的协同调控机理,明确肌腱祖细胞向肌腱分化调控机制。第三阶段,评估SCX复合力学分化的肌腱细胞修复再生修复肌腱的效率。实验表明：1)SCX可增加肌腱细胞外基质(胶原Ⅰ,ⅩⅣ)表达,并降低胶原Ⅱ表达及BMP活性。然而,SCX亦能增加runx2表达及骨诱导效果。2)在力学协同刺激下,SCX可增加肌腱特异性基因表达而诱导肌腱分化。3)体内异位种植及原位修复结果显示,SCX与力学有协同诱导分化及修复作用,可诱导胶原纤维成熟,并促进肌腱修复。结论：该研究表明SCX与力学不仅在肌腱分化中有重要作用,并且能够协同作用诱导肌腱分化与修复。SCX与力学刺激的协同作用部分是通过调控BMP-Smad通路及runx2的功能。该研究发现将为肌腱分化调控提控新知识,并将可能通过更准确调控干细胞腱系分化为肌腱再生的新的种子细胞和手段。第三章网状蚕丝-胶原海绵复合支架促肌腱再生研究目的：本课题致力于发明一种力学性能和生物学性能良好的生物材料,为肌腱韧带组织工程提供一种同时具备有良好力学性能和足够相通的细胞组织容纳空间的支架,即网状蚕丝复合胶原海绵支架。方法与结果：该支架用于韧带肌腱组织工程的功效性通过体外和动物体内进行评估。在胶原基质上培养的细胞与生长在蚕丝上的细胞高表达肌腱韧带的胞外基质基因。小鼠皮下移植实验结果显示蚕丝支架有很好的生物相容性,并会缓慢的降解。兔内侧副韧带损伤模型显示,将网状蚕丝复合胶原海绵支架用于内侧副韧带的修复得到更多的胶原沉积和更好的力学性能,与未修复和单纯蚕丝支架修复效果相比,实验组超微结构的胶原直径更大且支架和肌腱的交界点修复更强。结论：本研究结果证明了网状蚕丝复合胶原海绵支架通过调控肌腱韧带胞外基质基因的表达和胶原纤维的聚合促进了肌腱结构和功能的修复。这些发现第一次强调了生物材料在肌腱韧带再生生物学中的重要角色。另外,“内部空间预留”的支架概念的提出有利于处于力学张力下组织的修复。第四章基因工程化hESC-MSC与蚕丝-胶原海绵复合支架构建组织工程肌腱研究目的：我们之前的研究中已证明复合了胶原的蚕丝支架在肌腱再生中拥有良好的潜能,并证实hESC-MSCs及SCX+hESC-MSCs在肌腱分化及促进修复肌腱再生中的潜能。本研究旨在应用支架复合诱导后的胚胎干细胞构建组织工程肌腱,在动物模型中评估工程化的细胞与支架构成的组织工程肌腱对肌腱损伤修复的促进作用。方法与结果：体外实验将hESC-MSC及工程化SCX+hESC-MSC种在复合支架上在体外施以动态力学刺激(DM)或无力学刺激(NM)达14天。体内异位种植则埋入裸鼠皮下4周,部分通过将构建物缝合在裸鼠背部脊上韧带施以天然的力学刺激(DM),其他的则不受力(NM)。原位跟腱修复分别于固定后2周,4周,进行大体、组织学、超微结构、生化组成、生物力学检测。力学刺激诱导了复合胶原蚕丝支架上的hESC-MSC及SCX+hESC-MSC向肌腱方向分化,体内异位移植肌腱的组织学、生化组成和胶原表达、胶原纤维大小均大于无力学组,两种细胞间差异并不明显。肌腱修复结果显示细胞促进形成更成熟的胶原纤维,并促进损伤肌腱的修复。另外SCX+hESC-MSC可促进修复肌腱的力学性能,并增加胶原纤维成熟。结论：hESC-MSC及工程化SCX+hESC-MSC复合网状蚕丝-胶原海绵支架可构建组织工程肌腱,并促进损伤肌腱修复。SCX+hESC-MSC可进一步促进肌腱修复及胶原纤维成熟。

全文目录

致谢  5-6
中文摘要  6-11
ABSTRACT  11-17
缩略词  17-18
目次  18-23
绪论  23-27
1 第一章人胚胎干细胞的阶段性分化通过分泌胚胎肌腱基质和分化因子促进肌腱再生  27-65
  1.1 引言  27-29
  1.2 实验试剂与仪器  29-32
    1.2.1 材料和试剂(如无特殊说明均为invitrogen产品)  29
    1.2.2 实验仪器及材料  29-30
    1.2.3 相关溶液的配制  30-32
  1.3 实验方法  32-47
    1.3.1 MEF饲养层处理:  32
    1.3.2 hESC-MSC细胞培养  32-33
    1.3.3 hESC-MSC鉴定  33-36
    1.3.4 组织工程肌腱的制备  36
    1.3.5 体外静态力学刺激  36-37
    1.3.6 体内异位种植模型  37
    1.3.7 体内实验预染细胞-Dil  37
    1.3.8 损伤肌腱模型  37-38
    1.3.9 实时荧光定量PCR(real time PCR)  38-39
    1.3.10 力学测试  39
    1.3.11 组织学检测  39-41
    1.3.12 透射电镜检测组织工程肌腱的胶原纤维微观结构  41
    1.3.13 提取RNA  41-42
    1.3.14 逆转录合成cDNA  42
    1.3.15 引物设计  42-45
    1.3.16 胶原含量测定  45-46
    1.3.17 统计学分析  46-47
  1.4 实验结果  47-60
    1.4.1 分离和鉴定人胚胎干细胞来源的间充质干细胞(hESC-MSCs)  47-49
    1.4.2 hESC-MSCs在体内外构建肌腱样组织  49-51
    1.4.3 hESC-MSCs在原位促进髌腱的再生  51-55
    1.4.4 hESC-MSCs在促进髌腱的再生的机理研究  55-60
  1.5 讨论  60-65
2 第二章转录因子SCLERAXIS与力学刺激协同调控干细胞腱系分化机理和效应研究  65-101
  2.1 引言  65-68
  2.2 实验试剂与仪器  68-69
    2.2.1 材料(无特殊说明均购自invitrogen公司)  68
    2.2.2 质粒、载体及菌株  68
    2.2.3 试剂配制  68-69
  2.3 实验方法  69-78
    2.3.1 Scleraxis,scleraxis-GFP,Lacz及GFP慢病毒载体构建  69-73
    2.3.2 力学刺激诱导hESC-MSC分化  73-74
    2.3.3 力学刺激构建组织工程肌腱  74
    2.3.4 体内异位组织工程肌腱构建  74
    2.3.5 体内原位肌腱修复实验  74-75
    2.3.6 免疫荧光  75-76
    2.3.7 Western-blot  76-77
    2.3.8 LacZ-Xgal染色  77
    2.3.9 其余方法同第一章  77-78
  2.4 实验结果  78-95
    2.4.1 SCX稳定转染hESC-MSC  78-79
    2.4.2 SCX在平面培养条件下的诱导分化的作用  79-81
    2.4.3 SCX在三维培养条件下的协同力学刺激的诱导分化的作用  81-87
    2.4.4 力学刺激协同SCX诱导肌腱分化的机制研究  87-89
    2.4.5 力学刺激协同SCX体内异位诱导肌腱分化及胶原成熟  89-91
    2.4.6 力学刺激协同SCX体内原位修复肌腱损伤  91-94
    2.4.7 SCX协同力学刺激诱导肌腱分化模式  94-95
  2.5 讨论  95-101
3 第三章网状蚕丝-胶原海绵复合支架促肌腱再生研究  101-125
  3.1 引言  101-103
  3.2 实验试剂与仪器  103
    3.2.1 材料和试剂  103
    3.2.2 实验仪器及材料  103
    3.2.3 实验动物  103
    3.2.4 其余试剂仪器  103
  3.3 实验方法  103-110
    3.3.1 蚕丝胶原海绵复合支架制作  103-104
    3.3.2 电镜扫描(SEM)  104
    3.3.3 支架生物相容性、体内降解实验  104-105
    3.3.4 骨髓间充质干细胞分离、培养、传代、冻存  105
    3.3.5 蚕丝、胶原膜制备及细胞毒性反应性检测  105-106
    3.3.6 半定量PCR  106
    3.3.7 兔内侧副韧带修复实验  106-109
    3.3.8 其余方法同第一、二章  109-110
  3.4 实验结果  110-121
    3.4.1 支架形态学鉴定  110-111
    3.4.2 骨髓间充质干细胞在胶原和蚕丝膜上的反应  111-112
    3.4.3 支架体内降解和细胞毒性  112-113
    3.4.4 内侧副韧带(MCL)修复结果  113-121
  3.5 讨论  121-125
4 第四章工程化HESC-MSC与蚕丝-胶原海绵复合支架构建组织工程肌腱研究  125-140
  4.1 引言  125-126
  4.2 实验试剂与仪器  126
  4.3 实验方法  126-129
    4.3.1 体外力学刺激  126-127
    4.3.2 动物模型  127-128
    4.3.3 其余方法  128-129
  4.4 实验结果  129-137
    4.4.1 体外hESC-MSC组织工程肌腱构建  129-131
    4.4.2 体内异位hESC-MSC/SCX-hESC-MSC构建组织工程肌腱  131-133
    4.4.3 组织工程肌腱修复肌腱原位损伤  133-137
  4.5 讨论  137-140
5 总结  140-142
  5.1 肌腱种子细胞选择  140
  5.2 肌腱细胞诱导分化条件  140-141
  5.3 肌腱细胞诱导分化机制研究  141
  5.4 网状蚕丝-胶原海绵复合支架用于肌腱修复研究  141
  5.5 力学刺激，胚胎干细胞复合支架构建组织工程肌腱研究  141-142
参考文献  142-151
综述  151-186
作者简历及在读期间所取得的科研成果  186-188

胚胎干细胞与蚕丝—胶原支架促进肌腱再生的研究

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