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玉米弯孢菌叶斑病抗性相关蛋白质鉴定及功能研究

作　者: 黄秀丽
导　师: 陈捷
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 玉米 弯孢菌叶斑病 抗性基因 双向电泳技术 质谱鉴定技术
分类号: S435.131
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 266次
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内容摘要


弯孢菌叶斑病(Curvularia lunata(Wakker)Boed)是威胁我国玉米可持续生产的主要病害之一,培育和种植抗病品种是防治该病害发生与危害的根本途径。然而,目前我国缺少对该病免疫的品种,且病原菌具有明显的致病性分化现象,极易导致品种抗性丧失,为此,从目前已有的抗性种质资源中挖掘抗病基因,对培育持续抗性新种质具有重要意义。本研究利用以双向电泳(2-DE)和质谱(MS)鉴定为核心的蛋白质组学技术,筛选玉米弯孢菌叶斑病抗性相关蛋白质和基因,并研究其在寄主抗性中的作用,主要内容及结果如下:1.分析了弯孢叶斑病菌侵染玉米抗、感自交系后防御相关因子变化规律。结果表明:病原菌侵染后,抗性自交系中SA及O2-含量显著提高,病程相关蛋白PR-1、PR-10、PAL、CAT、POX等的转录水平也显著提高,而感病自交系中ABA含量显著提高,防卫基因转录水平也有提高但是不显著。由此推测,SA增强了玉米对弯孢菌叶斑病的抗性,ABA则相反,增强了玉米对该病害的易感性,而ROS的积累在早期抗性反应中发挥重要作用,PR-1、PR-10、PAL及ROS清除酶类也参与了玉米抗弯孢叶斑病菌侵染的防御反应。2.建立了基于2-DE技术的玉米叶片蛋白质高效分离系统。通过对蛋白质样品制备、蛋白质裂解液配方、IPG胶条pH范围和等电聚焦电泳时间等参数的优化,建立了玉米叶片总蛋白质分离的2-DE体系。同时,建立了以去除叶片高丰度蛋白Rubisco为主要目标的Mg/NP-40及PEG预分离体系,明显提高了2-DE系统对低丰度蛋白质的分离效率。3.鉴定出了部分与玉米抗弯孢菌叶斑病相关的蛋白质。通过对抗、感玉米自交系接种弯孢叶斑病菌后叶片蛋白质2-DE图谱的比较,利用MALDI-TOF MS/MS成功鉴定了36个差异表达的蛋白质点,其中与该病抗性密切相关的蛋白质包括22 kDa干旱诱导蛋白、脱落酸/成熟诱导蛋白Asr、萌发素类似蛋白GLP、谷胱甘肽过氧化物酶GPX、抗坏血酸过氧化物酶APX、翻译起始因子eIF-5A和ras相关蛋白等。光合作用、能量代谢等相关蛋白质也参与了玉米抗弯孢叶斑病菌侵染应答反应。综合分析,玉米耐受干旱和抗氧化胁迫相关蛋白质可能是玉米抗弯孢叶斑病菌侵染的重要因子,在玉米耐受逆境胁迫及抗病反应的“交叉对话”中发挥重要作用。4.克隆了玉米弯孢菌叶斑病抗性相关基因ZmDip。根据质谱鉴定结果,成功克隆了玉米22 kDa干旱诱导蛋白编码基因ZmDip且实现了其在大肠杆菌E. coli中的高效表达,并纯化了目的蛋白,为制备该蛋白的多克隆抗体提供了条件。本研究还发现ZmDip与Riccardi和Jeanneau等报道的ZmAsr1基因有98%的一致性,蛋白序列有99%的一致性,且均定位于10号染色体上,由此推测,ZmDip与ZmAsr1为同一个基因,两者之间核苷酸及编码蛋白的微小差异可能与基因来源即玉米基因型有关。5. ZmDip表达特性及弯孢叶斑病菌侵染后转录水平变化分析。利用半定量RT-PCR对ZmDip的表达特性进行了分析,发现该基因在正常生长的玉米根部表达,叶鞘不表达,而叶片中该基因的表达比较复杂,可能与玉米基因型有关。外源ABA、SA均能诱导该基因的表达,弯孢叶斑病菌侵染后,抗、感自交系中该基因的转录水平也发生变化,但与接种后寄主植物叶片中ABA、SA含量变化没有一致性,由此认为,ZmDip基因的表达可能主要受ABA、SA以外的其它路径调控。6.ZmDip表达提高了玉米叶片抗弯孢叶斑病菌侵染的能力。ZmDip基因在玉米离体叶片中的表达,促进了ROS主要是O2-的积累,抑制了弯孢叶斑病菌的侵染。因此,初步认为ZmDip基因表达调控了ROS代谢,从而提高了玉米对弯孢叶斑病菌侵染的抵抗力。至于该基因参与寄主植物抗性反应的具体路径,还需深入研究。

全文目录


中文摘要  4-6
英文摘要  6-16
英文缩略表  16-18
第一章 文献综述  18-44
  1 植物抗病相关基因及克隆技术  18-21
    1.1 植物抗病相关基因类型  18
    1.2 植物抗病相关基因克隆技术  18-21
      1.2.1 转座子标签技术  19
      1.2.2 定位克隆技术  19
      1.2.3 同源克隆技术  19
      1.2.4 mRNA 差异显示技术  19-20
      1.2.5 基因芯片技术  20
      1.2.6 表达序列标签技术  20
      1.2.7 蛋白质组学技术  20-21
      1.2.8 其它技术  21
  2 植物抗病机制研究进展  21-24
    2.1 植物抗病类型  22
    2.2 植物抗病分子基础  22-24
      2.2.1 木质素  22-23
      2.2.2 植保素  23
      2.2.3 活性氧  23
      2.2.4 水杨酸  23-24
      2.2.5 病程相关蛋白  24
      2.2.6 防御酶系  24
  3 蛋白质学及其在植物抗病研究中的应用  24-29
    3.1 蛋白质组学定义及研究内容  24-25
    3.2 蛋白质组学研究的关键技术  25-27
      3.2.1 蛋白质分离技术  25-26
      3.2.2 质谱鉴定技术  26
      3.2.3 生物信息学技术  26-27
    3.3 蛋白质组学在植物病害研究中的应用  27-29
      3.3.1 水稻、小麦等病害蛋白质组学研究  27-28
      3.3.2 玉米病害蛋白质组学研究  28-29
  4 玉米弯孢菌叶斑病研究概况  29-34
    4.1 玉米弯孢菌叶斑病的危害与防治  29-30
    4.2 玉米弯孢菌叶斑病病原学研究概况  30-32
      4.2.1 病原菌  30-31
      4.2.2 致病性分化  31-32
      4.2.3 毒素分析  32
    4.3 玉米弯孢菌叶斑病抗性机制研究概况  32-34
  5 本论文的研究内容及技术路线  34-35
    5.1 研究背景  34
    5.2 立题依据  34-35
    5.3 研究内容  35
    5.4 技术路线  35
  6 预期目标及可能存在的问题  35-36
    6.1 预期目标  35-36
    6.2 存在的问题及展望  36
  参考文献  36-44
第二章 玉米抗弯孢叶斑病菌侵染相关防御因子分析  44-58
  1 材料与方法  44-47
    1.1 材料与试剂  44
      1.1.1 材料  44
      1.1.2 试剂  44
    1.2 试验方法  44-47
      1.2.1 孢子悬浮液制备  44-45
      1.2.2 接种及取样  45
      1.2.3 SA、ABA 及ROS 含量测定  45
      1.2.4 防卫基因转录水平分析  45-47
  2 结果与分析  47-52
    2.1 弯孢叶斑病菌侵染后SA 含量变化  47
    2.2 弯孢叶斑病菌侵染后ABA 含量变化  47-48
    2.3 弯孢叶斑病菌侵染后ROS 含量变化  48-49
    2.4 弯孢叶斑病菌侵染后防卫基因转录水平分析  49-52
      2.4.1 病程相关蛋白  49
      2.4.2 防御酶系  49-52
  3 讨论  52-54
    3.1 SA 增强了玉米弯孢菌叶斑病抗性  52
    3.2 ABA 增强了玉米弯孢菌叶斑病易感性  52
    3.3 ROS 在玉米弯孢菌叶斑病早期抗性中发挥重要作用  52-53
    3.4 PR-1,10 及PAL 参与玉米弯孢菌叶斑病抗性防御反应  53-54
  参考文献  54-58
第三章 玉米叶片蛋白质分离2-DE 体系建立与优化  58-72
  1 材料与方法  58-62
    1.1 材料与试剂  58-59
      1.1.1 材料  58
      1.1.2 试剂  58-59
    1.2 试验方法  59-62
      1.2.1 取样  59
      1.2.2 优化方案  59
      1.2.3 2-DE 试验流程  59-62
  2 结果与分析  62-68
    2.1 玉米叶片总蛋白质分离2-DE 体系的优化  62-66
      2.1.1 总蛋白质提取方法的确定  62-63
      2.1.2 裂解液中尿素最佳浓度的确定  63-64
      2.1.3 等电聚焦时间的优化  64-65
      2.1.4 IPG 胶条pH 范围的确定  65-66
    2.2 玉米叶片去除高丰度蛋白质2-DE 体系的优化  66-68
      2.2.1 去除高丰度蛋白质最佳PEG 浓度的确定  66-67
      2.2.2 去除高丰度蛋白质对2-DE 图谱的影响  67-68
  3 讨论  68-70
    3.1 玉米叶片总蛋白质沉淀方法  68
    3.2 PEG 沉淀法去除高丰度蛋白Rubisco  68-69
    3.3 尿素对蛋白质样品裂解效果的影响  69
    3.4 等电聚焦时间对2-DE 图谱的影响  69
    3.5 IPG 胶条pH 范围对2-DE 图谱的影响  69-70
  参考文献  70-72
第四章 玉米弯孢菌叶斑病抗性相关蛋白质鉴定  72-98
  1 材料与方法  72-75
    1.1 材料与试剂  72-73
      1.1.1 材料  72
      1.1.2 试剂  72-73
    1.2 试验方法  73-75
      1.2.1 孢子悬浮液制备  73
      1.2.2 接种及取样  73
      1.2.3 2-DE 试验流程  73-74
      1.2.4 质谱分析及数据库检索  74-75
  2 结果与分析  75-90
    2.1 弯孢叶斑病菌侵染后总蛋白质2-DE 图谱的比较  75-80
    2.2 弯孢叶斑病菌侵染后去除高丰度蛋白质2-DE 图谱的比较  80-84
    2.3 差异蛋白质点质谱鉴定结果  84-90
  3 讨论  90-92
    3.1 遗传背景对抗性相关蛋白质筛选效率的影响  90
    3.2 光合作用及能量代谢相关蛋白参与侵染应答反应  90
    3.3 寄主抗氧化胁迫相关蛋白参与侵染应答反应  90-91
    3.4 寄主抗干旱胁迫相关蛋白参与侵染应答反应  91
    3.5 蛋白质合成相关蛋白参与侵染应答反应  91-92
    3.6 其它抗性相关蛋白  92
  参考文献  92-98
第五章 玉米弯孢叶斑病抗性基因ZmDip 克隆及表达  98-118
  1 材料与方法  98-103
    1.1 材料与试剂  98-99
      1.1.1 材料  98
      1.1.2 试剂  98-99
    1.2 试验方法  99-103
      1.2.1 孢子悬浮液制备  99
      1.2.2 接种及取样  99
      1.2.3 cDNA 克隆  99-100
      1.2.4 基因组扩增  100-101
      1.2.5 Southern blot  101
      1.2.6 原核表达载体的构建  101-102
      1.2.7 目的蛋白的诱导表达  102
      1.2.8 SDS-PAGE 检测表达产物  102
      1.2.9 表达蛋白的可溶性分析  102
      1.2.10 表达产物的Western blot 分析  102
      1.2.11 表达产物的纯化  102-103
      1.2.12 重组子耐盐特性分析  103
  2 结果与分析  103-113
    2.1 干旱诱导蛋白cDNA 克隆及序列分析  103-108
    2.2 ZmDip 基因 Southern blot 分析  108-109
    2.3 ZmDip 基因原核表达载体构建及分析  109
    2.4 重组蛋白的诱导表达  109-110
    2.5 表达产物的 Western blot 分析  110-111
    2.6 重组蛋白的纯化  111-112
    2.7 重组子耐盐特性分析  112-113
  3 讨论  113-114
    3.1 ZmDip 与 ZmAsr1 为同一个基因  113
    3.2 ZmDip 重组蛋白以二聚体形式存在于胞质中  113-114
    3.3 ZmDip 基因提高了细菌耐盐性  114
  参考文献  114-118
第六章 ZmDip 与玉米弯孢菌叶斑病抗性关系的探讨  118-135
  1 材料与方法  118-123
    1.1 材料与试剂  118-119
      1.1.1 材料  118-119
      1.1.2 试剂  119
    1.2 试验方法  119-123
      1.2.1 孢子悬浮液制备  119
      1.2.2 接种及取样  119-120
      1.2.3 ZmDip 表达特异性分析  120
      1.2.4 ABA、SA 对ZmDip 转录水平的影响  120
      1.2.5 弯孢叶斑病菌侵染后ZmDip 转录水平分析  120
      1.2.6 植物表达载体pBI-Zm Dip-Gus 的构建  120-121
      1.2.7 农杆菌介导的ZmDip 瞬时表达  121-122
      1.2.8 ZmDip 表达对ROS 及清除酶活性的影响  122
      1.2.9 ZmDip 表达对玉米抗弯孢叶斑病菌侵染的影响  122-123
  2 结果与分析  123-130
    2.1 ZmDip 表达特性分析  123-124
    2.2 弯孢叶斑病菌侵染后ZmDip 转录水平的变化  124-125
    2.3 重组载体构建及农杆菌介导的瞬时表达  125-126
    2.4 ZmDip 表达对ROS 含量及清除酶系活性的影响  126-128
    2.5 ZmDip 表达对玉米抗弯孢叶斑病菌侵染的影响  128-130
  3 讨论  130-131
    3.1 ZmDip 表达具有组织特异性  130
    3.2 ZmDip 表达与SA、ABA 积累可能没有直接相关性  130
    3.3 ZmDip 表达与ROS 代谢有关  130-131
  参考文献  131-135
第七章 结论及后续工作展望  135-137
  1 创新点  135
  2 主要结论  135-136
  3 后续工作展望  136-137
致谢  137-138
附录 攻读学位期间发表文章及其它  138-142

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