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人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达

作　者: 侯春喜
导　师: 赵寿经
学　校: 吉林大学
专　业: 农业生物环境与能源工程
关键词: 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD) β-香树素合成酶(βAS) RACE 反义RNA 人参皂苷
分类号: S567.51
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

人参是我国道地中药植物,其活性成分主要是次生代谢过程中产生的人参皂苷。深入研究人参皂苷生物合成途径关键酶基因的结构与功能,以及利用基因工程手段调控这些关键酶基因活性,达到调控提高人参皂苷含量的目的,将具有重要的理论和实际应用价值。本论文选择二个具有代表性的基因为研究对象,开展了基因克隆及利用反义RNA技术调控人参皂苷生物合成的尝试工作。这二个基因分别是人参皂苷生物合成上游关键酶基因,既催化异戊二烯途径第一个前体物-异戊烯二磷酸(IPP)合成焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(MVD),另一个基因是人参皂苷生物合成下游关键酶基因β-香树素合成酶基因(βAS),该基因编码的β-香树素合成酶是催化人参皂苷R0(人参次要活性成分)合成的关键酶。本论文用SMART RACE技术扩增人参MVD基因的保守序列,3’片段和5’片段,结果经过序列比对分析和拼接得到一个ORF为1254bp的片段,用此基因的ORF两端设计引物,扩增得到其cDNA全长。人参MVD基因在大肠杆菌中成功表达,其编码的蛋白分子量大小是46kd,与基因序列分析结果一致。(MVD基因在GenBank中的登录号:GQ455989)。利用反义表达策略,首次研究了βAS基因在人参皂苷生物合成中的功能。通过构建反义pBI121-AβAS植物表达载体,转入工程菌A4后转化人参根,对转化条件进行了筛选,获得反义人参发根系A5,A9,A19,A24和A30,Southern杂交结果显示目的基因拷贝数都是单拷贝。Northern杂交显示5株反义发根中的βAS转录水平显著下降,也说明反义βAS的导入确实可降低βAS的转录量,最多比对照组降低1/3。对酶活分析显示,反义发根系βAS活性均降低,同时,转基因发根系DAS活性被上调,DAS活性在所有的转化组中都获得增加,尤其在A19中增加了1.2倍。化学分析结果显示皂苷合成前体物2,3氧化鲨烯的积累增加。人参皂苷含量分析结果表明,齐敦果烷型人参皂苷R0含量均降低,最多降40%,转化发根的达玛烷型人参皂苷含量最高增加到原来的1.3倍,并且单体皂苷Rb1, Rb2, Rc, Rd,Re,Rf和Rg1均不同程度增加。这些研究成果对于促进MVD的异源表达、提高人参皂苷含量的种质资源的研究具有重要的指导作用,为调控人参皂苷的含量及人参代谢工程的研究奠定了理论和实践基础,具有广阔的应用前景。

全文目录

内容提要  4-10
第1章绪论  10-28
  1.1 研究目的、意义及内容  10-13
    1.1.1 研究目的  10-12
    1.1.2 研究意义  12
    1.1.3 研究内容  12-13
  1.2 人参皂苷的生物合成  13-15
    1.2.1 人参皂苷生物合成步骤  13-14
    1.2.2 人参皂苷生物合成调控  14-15
  1.3 人参皂苷生物合成关键酶基因  15-21
    1.3.1 人参皂苷生物合成上游关键酶基因—焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（MVD）  15-16
      1.3.1.1 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（MVD）结构特点  15-16
      1.3.1.2 焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（MVD）功能分析  16
    1.3.2 人参皂苷合成下游关键酶基因βAS的研究  16-19
      1.3.2.1 β-香树素合成酶基因（βAS）结构特点  16-17
      1.3.2.2 β-香树素合成酶基因（βAS）突变对活性影响  17-18
      1.3.2.3 β-香树素合成酶基因（βAS）同源酶基因  18-19
    1.3.3 人参皂苷生物合成其他关键酶基因  19-21
      1.3.3.1 人参皂苷生物合成关键酶基因—3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（HMGR）  19-20
      1.3.3.2 人参皂苷生物合成关键酶基因—鲨烯合成酶基因（SS）  20
      1.3.3.3 人参皂苷生物合成关键酶基因—鲨烯环氧酶基因（SE）  20-21
  1.4 发根农杆菌介导的植物遗传转化  21-23
    1.4.1 遗传转化外源基因资源  21-22
    1.4.2 基因rol对人参发根诱导的作用  22
    1.4.3 人参发根植株再生  22-23
  1.5 反义RNA技术在植物中的研究进展  23-28
    1.5.1 调控次生代谢产物  24
    1.5.2 调控果实成熟  24-25
    1.5.3 改良作物品质  25-27
    1.5.4 改变植物花色  27-28
第2章人参皂苷生物合成上游基因MVD的克隆  28-60
  2.1 材料与方法  29-41
    2.1.1 实验材料  29-31
      2.1.1.1 植物材料  29
      2.1.1.2 载体、菌株与引物  29-30
      2.1.1.3 试剂  30-31
    2.1.2 实验方法  31-41
      2.1.2.1 人参发根总RNA的三种不同方法提取  31-32
      2.1.2.2 人参MVD保守片段的克隆  32-34
      2.1.2.3 3’RACE扩增人参MVD的3’端片段  34-35
      2.1.2.4 5’RACE扩增人参MVD的5’端片段  35-37
      2.1.2.5 人参MVD的全长ORF扩增  37-38
      2.1.2.6 人参MVD基因的生物信息学分析  38
      2.1.2.7 人参MVD基因的原核表达  38-41
  2.2 结果与分析  41-56
    2.2.1 三种提取人参发根总RNA方法的比较  41-43
    2.2.2 人参MVD基因克隆及序列分析  43-51
      2.2.2.1 中间保守序列的扩增结果  43-45
      2.2.2.2 人参MVD的3’RACE扩增结果  45-47
      2.2.2.3 人参MVD的5’RACE扩增结果  47-48
      2.2.2.4 人参MVD全长ORF的扩增结果  48-51
    2.2.3 人参MVD蛋白的特征分析  51-52
    2.2.4 人参MVD蛋白的三维模型分析  52-53
    2.2.5 人参MVD基因的系统发生树分析  53-54
    2.2.6 人参MVD原核表达载体构建  54-55
    2.2.7 人参MVD的原核表达  55-56
  2.3 讨论  56-58
    2.3.1 RNA提取  56
    2.3.2 保守片段的兼并引物设计  56-57
    2.3.3 克隆MVD基因的方法  57
    2.3.4 原核表达载体的构建  57-58
    2.3.5 MVD原核表达  58
  2.4 小结  58-60
第3章反义βAS植物表达载体及其工程菌的构建  60-78
  3.1 材料与方法  61-66
    3.1.1 实验材料  61
      3.1.1.1 植物材料  61
      3.1.1.2 试剂  61
    3.1.2 实验方法  61-66
      3.1.2.1 RNA的提取  61
      3.1.2.2 反转录  61-62
      3.1.2.3 βAS基因cDNA的克隆  62-63
      3.1.2.4 受体菌株的选择  63
      3.1.2.5 植物表达载体的构建  63-65
      3.1.2.6 PCR-Southern Blot 分析  65-66
  3.2 结果与分析  66-74
    3.2.1 β-香树素合成酶基因扩增  66-67
    3.2.2 克隆载体的酶切和质粒测序  67-68
    3.2.3 测序结果分析  68-69
    3.2.4 受体菌株的选择  69-70
    3.2.5 反义βAS植物表达载体（pBI-AβAS、pROK-AβAS和pCAMBIA 3 301-AβAS）的构建及酶切鉴定  70-73
    3.2.6 反义βAS工程菌发根农杆菌A4 的PCR-Southern杂交鉴定  73-74
  3.3 讨论  74-76
    3.3.1 βAS基因的反义表达载体构建  74-75
    3.3.2 反义表达载体选择  75
    3.3.3 农杆菌冻融法转化及质粒提取  75-76
    3.3.4 含βAS三种重组发根农杆菌的PCR-Southern杂交鉴定  76
    3.3.5 人参βAS 基因研究  76
  3.4 小结  76-78
第4章反义βAS发根农杆菌对人参的遗传转化及其对人参皂苷含量的影响  78-100
  4.1 材料和方法  79-84
    4.1.1 实验材料  79
      4.1.1.1 植物材料  79
      4.1.1.2 试剂及培养基  79
    4.1.2 实验方法  79-84
      4.1.2.1 人参根外植体消毒和接种  79-80
      4.1.2.2 GUS瞬时表达检测  80
      4.1.2.3 反义βAS发根农杆菌转化人参条件研究  80-81
      4.1.2.4 Southern blot分析  81-82
      4.1.2.5 Northern blot分析  82
      4.1.2.6 人参皂苷含量分析  82-83
      4.1.2.7 DAS和βAS酶活分析  83
      4.1.2.8 2,3-氧化鲨烯含量分析  83
      4.1.2.9 反义βAS人参发根A19 的达玛烷皂苷含量分析  83-84
  4.2 结果与分析  84-94
    4.2.1 反义βAS发根农杆菌转化人参条件研究  84-88
      4.2.1.1 农杆菌 A4 (pCAMBIA3301-AβAS, pROK-AβAS,pBI121-AβAS) 侵染结果  84
      4.2.1.2 农杆菌 A4 (pBI121-AβAS)不同浓度及侵染时间  84-85
      4.2.1.3 预培养、共培养对人参转化的影响  85-86
      4.2.1.4 添加AS对人参转化的影响  86-88
    4.2.2 反义βAS诱导人参发根的结果  88
    4.2.3 反义βAS人参发根的Southern blot鉴定  88-89
    4.2.4 反义βAS人参发根的Northern blot鉴定  89-90
    4.2.5 反义βAS发根中齐敦果烷型人参皂苷R B0B的含量分析  90
    4.2.6 DAS和βAS酶活分析  90-91
    4.2.7 反义βAS发根中2，3-氧化鲨烯分析和达玛烷人参皂苷HPLC分析  91-92
    4.2.8 反义βAS发根系A19 培养过程中达玛烷皂苷含量变化  92-94
  4.3 讨论  94-98
    4.3.1 影响转化的因素  95
    4.3.2 转反义βAS对人参生长的影响  95-96
    4.3.3 转反义βAS人参发根的Southern、Northern杂交分析  96-97
    4.3.4 转反义βAS对人参皂苷合成酶的影响  97
    4.3.5 转反义βAS对达玛烷型人参皂苷的影响  97-98
  4.4 小结  98-100
第5章全文总结与展望  100-102
  5.1 总结  100
  5.2 展望  100-102
参考文献  102-115
英文缩写  115-116
发表文章  116-117
致谢  117-118
中文摘要  118-121
Abstract  121-123

人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达

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