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抑癌基因SLC5A8在食管癌组织中的甲基化状态分析

作　者: 雷霆
导　师: 胡祥
学　校: 大连医科大学
专　业: 中西医结合
关键词: SLC5A8 Barrett食管 食管癌 DNA甲基化 表观遗传学
分类号: R735.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:食管癌是较常见的一种消化道恶性肿瘤,发病率为69-166 /10万,每年新增患者超过30万人,并且大多发生于发展中国家。估计全世界每年约有20万人死于食管癌,在世界最常见的10种恶性肿瘤发病率中名列第六,在中国排名第四。其具有明显的地区性分布及治愈率低的特点,目前对其研究相对较少,它的发生、发展可能与遗传、种族、不良生活习惯、饮食习惯、口腔卫生等密切相关,研究证明食管癌病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程,涉及多种癌基因和抑癌基因的异常。但其确切的发病机制并不明确。目前对食管癌的诊断主要依靠钡餐透视及食管镜等检查,许多患者在确诊时已属晚期。临床上缺乏一种有效的早期诊断及预后判断方法。因此深入了解食管癌的分子生物学发病机制,寻找有效的早期诊断方法是降低食管癌高死亡率的关键。近十几年来Barrett食管在我国出现了明显增长的趋势。其形成主要是由于胃食管反流破坏了食管正常的鳞状上皮之后,导致对消化液有较强抵抗能力的柱状上皮代替了鳞状上皮所形成的一种病理过程。在这一病变的基础上,经常发生消化性溃疡、肠上皮化生、异型增生、直至食管腺癌。目前认为,Barrett食管病人发生食管癌的危险性是正常人群的30～125倍,伴有重度异型增生的Barrett食管发展成为腺癌的几率达50%,其演变为腺癌的过程为上皮化生-异型改变-腺癌三个阶段,因而其被看做是食管癌的一种癌前病变。因此,对Barrett食管患者加强监测是非常必要的。表观遗传学改变被认为是继基因结构变异如点突变、插入、缺失、异位等遗传信息形式的改变之外的另一种不涉及基因序列的改变而可遗传的并且可导致恶性肿瘤相关基因(包括原癌基因及抑癌基因)功能异常的重要基因失活方式。包括DNA的甲基化/去甲基化及组蛋白的乙酰化/去乙酰化等不同状态。而DNA甲基化是最早发现的表观修饰途径之一,主要发生在CpG岛二核苷酸序列的胞嘧啶上,并证实与多种肿瘤的发生密切相关。大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因的表达。DNA的甲基化是指生物体由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)所催化介导下,以S-腺苷蛋氨酸(s-adenosyl-methionine, SAM)作为甲基基团的供体,将甲基基团转移到胞嘧啶上,生成5mC的过程。在哺乳动物体内至少有三种DNA甲基转移酶参与DNA甲基化的形成和维持,包括DNMT1、DNMT3a及DNMT3b。甲基转移酶催化DNA甲基化的形成,包括从头甲基化(de novo methylation)和维持甲基化(maintenance methylation)。DNMTs活性的增加可以使DNA发生异常甲基化并可引起染色体的不稳定。甲基转移酶的异常表达有可能对多个基因包括SLC5A8及肿瘤的CpG岛甲基化表型产生重要的影响。在肿瘤组织中存在着全基因组的广泛的低甲基化和CpG岛局部的高甲基化的异常现象,它既是肿瘤发生、发展的重要特征又是其产生的重要原因。DNA甲基化降低了基因序列与特异性转录因子结合的亲和力,导致受累基因完全不能转录从而丧失其功能。这种表型遗传修饰没有改变基因的序列,但是对肿瘤相关基因的表达却起到重要的调控作用。多基因、多位点的同时DNA甲基化也被称作CpG岛甲基化表型(CpG Island Methylator Phenotype,CIMP),不同CpG岛甲基化表型的肿瘤其发生、发展机制及预后都不尽相同,许多研究证实CpG岛甲基化表型涉及一系列肿瘤相关基因的表达调节,在肿瘤发生、发展中起着重要的作用。目前对于肿瘤相关基因的异常甲基化状态的研究是肿瘤发生机制研究领域的热点。近年来的研究发现抑癌基因SLC5A8(the solute carrier family 5 member 8 gene)与人类多种肿瘤的发生密切相关。SLC5A8位于人染色体的12q22-23,属NA+/葡萄糖共转运蛋白家族的成员,是由NA+偶联的转运短链脂肪酸(SCFAs)和其它单羧酸,如乳酸盐、丙酮酸盐的载体;同时新近发现其亦是一种抑癌基因,其外显子1的CpG岛的甲基化及组蛋白去乙酰化可使其基因表达沉默,促进肿瘤的发生。目前已在多种恶性肿瘤中发现其异常高甲基化,在各种结肠肿瘤标记物中,它是第一个与肿瘤抑制功能相关的膜转运蛋白,但在食管癌及Barrett食管中SLC5A8的甲基化情况尚不得而知。本课题以临床食管癌患者术后标本、其癌前病变-Barrett食管及食管癌患者术前、术后血浆为研究对象,并以癌旁组织、切缘正常粘膜为对照,运用甲基化特异性PCR法(Methylation-specific PCR, MSP)检测上述组织中抑癌基因SLC5A8的甲基化情况;使用RT-PCR法及Western-blot法分别从mRNA和蛋白水平对该基因在食管癌组织、癌旁组织和正常粘膜的表达进行检测,探讨其在食管癌发生、发展中的作用以及和各临床相关因素的关系。并进一步分析了甲基转移酶对SLC5A8启动子区域甲基化状态的影响及食管癌组织全基因组甲基化的特点。大连地区是食管癌的高发区,研究该地区食管癌发生、发展的分子生物学改变有助于人们深入地了解食管癌在该地区的发生、发展机制,对于制定食管癌的预防措施、寻找早期诊断方法和治疗策略、判断预后等方面具有重要的意义。方法:45例食管癌新鲜病理标本组织取自本院2007年1月至2008年4月间的手术切除标本,每例均取癌组织、癌旁组织(距肿瘤边缘0.5cm)及切缘组织(距肿瘤边缘5cm以上的正常食管粘膜)。男性38例,女性7例。年龄41-81岁,中位年龄60岁,据UICC食管癌TNM分期标准(2002),45例患者中Ⅰ期4例,ⅡA期13例,ⅡB期8例,Ⅲ期16例,Ⅳ期4例;鳞癌34例,腺癌11例;高分化11例,中分化18例,低分化16例;食管上段6例,中段17例,下段22例。标本于手术切除后半小时内于液氮中保存后转至-80℃电冰箱中,所有患者术前均未接受放化疗。30例食管癌患者于术前、术后分别留取血液2毫升,离心后血浆于-80℃冰箱中保存。42例Barrett食管及其正常的食管粘膜取自本院胃镜室(病变处取两处、正常粘膜取一处),样本保存于液氮中。所有患者均为大连地区常住居民。本研究采用甲基化特异性PCR法(Methylation-specific PCR, MSP)检测45例食管癌患者肿瘤组织、癌旁组织、切缘正常食管粘膜组织;42例Barrett食管粘膜以及30例食管癌患者术前、术后血浆中SLC5A8甲基化状态;采用RT-PCR法及Western-blot检测组织中SLC5A8基因的表达情况;同时检测甲基化转移酶(DNMTs)在食管癌肿瘤组织及切缘组织中的表达情况及食管癌组织中全基因组甲基化的特点。数据使用SPSS12.0 for windows统计软件包进行统计分析,使用χ2检验和Fisher精确概率法对各组间率进行比较,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:一.食管癌组织、癌旁组织、切缘组织中SLC5A8基因表达情况RT-PCR法:SLC5A8基因在食管癌组织、癌旁组织及切缘组织中的表达率分别为26.7%(12/45)、73.3%(33/45)及91.1%(41/45),癌组织中基因表达率显著低于癌旁组织及切缘组织(χ2=19.6, P< 0.01;χ2=38.59,P<0.01)。为了证实RT-PCR的实验结果,随机选择8例食管癌患者,使用Western印迹杂交法对其食管癌组织、癌旁组织及切缘组织中SLC5A8的蛋白水平的表达进行检测,结果与RT-PCR法结果相一致,分别为25.0%(2/8)、75.0%(6/8)及87.5%(7/8)。二.食管癌组织、癌旁组织、切缘组织中SLC5A8甲基化状态45例食管癌组织、癌旁组织、切缘组织中SLC5A8甲基化率阳性分别为68.8%(31/45)、11.1%(5/45)、4.4%(2/45),癌组织的甲基化阳性率(68.8%)显著高于癌旁组织(11.1%)及切缘组织(4.4%)(χ2=31.3,P<0.01;χ2= 28.38, P<0.01);癌旁组织(11.1%)及切缘组织(4.4%)甲基化阳性率之间的差异无统计学意义(χ2=1.39,P>0.05)。食管癌组织甲基化状况与病人性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、TNM分期及病理类型无关(P>0.05)。三.食管癌组织中SLC5A8基因表达状况及与SLC5A8基因甲基化的关系45例食管癌组织中SLC5A8基因表达率为26.7%(12/45),癌组织中基因表达率显著低于癌旁组织及切缘组织。31例SLC5A8甲基化阳性标本中仅有2例(6.45%)检测到SLC5A8的表达;而14例SLC5A8甲基化阴性的标本中有10例(71.4%)检测到其表达。SLC5A8甲基化阳性的食管癌组织中SLC5A8基因表达率显著低于甲基化阴性的食管癌组织,两者呈明显负相关(χ2 =21.168,P<0.001)。四.Barrett食管SLC5A8甲基化情况Barrett食管SLC5A8甲基化阳性率(35.7%)显著高于其正常食管粘膜的甲基化阳性率(9.5%),差异具有统计学意义(χ2=8.23, P<0.01 )。SLC5A8基因甲基化状态随着不同病理进展(正常粘膜-Barrett食管-食管癌)呈现增加的趋势,并且这种甲基化状态的增加在不同病理阶段存在明显差异(χ2=8.23, P<0.01;χ2=9.59,P<0.01)。五.食管癌患者术前、术后血浆中SLC5A8甲基化状态30例食管癌患者术前、术后血浆中SLC5A8甲基化率分别为43.3%(13/30)、16.7%(5/30),术前血浆SLC5A8甲基化阳性的13名患者中有8名在接受食管癌根治性手术后转为阴性,术后血浆中SLC5A8甲基化率明显低于术前(χ2 =5.08,P<0.05)。食管癌组织中甲基化阴性的患者其术前、术后血浆中均未检测出SLC5A8基因甲基化。六.甲基转移酶对SLC5A8启动子区域甲基化状态的影响1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在45例食管癌患者的肿瘤组织、正常粘膜组织中的表达率分别为64.4%(29/45)、22.2%(10/45);24.4%(11/45)、31.1%(14/45)及31.1%(14 /45)、33.3%(15/45)。DNMT1在两者之间的差异统计学意义(χ2=16.33, P<0.05)。2、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在31例甲基化阳性的食管癌患者的肿瘤组织中的表达率分别为80.6%(25/31)、22.6%(7/31)及29.0%(9/31),三者之间的差异有统计学意义(χ2=6.97, P<0.05)。七.食管癌全基因组甲基化特点1、食道癌组织中存在全基因组DNA低甲基化的趋势。2、未发现来源于相同患者的癌组织以及对应切缘相对正常组织中甲基化状态的明显差异。结论:一.抑癌基因SLC5A8在食管癌组织中的表达下降,甲基化的发生是其中的重要机制之一。甲基化可以引起抑癌基因SLC5A8沉默、表达下降,进而影响其正常生理功能,导致癌变的发生与进展。二.在食管癌的癌前病变-Barrett食管时期即可出现SLC5A8甲基化现象,并随着病理的进展而增加,在正常粘膜、Barrett食管、食管癌组织中甲基化状态呈现明显增加的趋势,提示抑癌基因SLC5A8甲基化是食管癌发生的早期分子事件并且是Barrett食管转变为食管癌的机制之一。三.血浆中SLC5A8基因甲基化检测可作为术前诊断的一项简便的、无创的生物学方法,联合其他抑癌基因的甲基化检测(CIMP)有可能在监测放化疗反应与预后判断等领域中得到广泛应用。四.在SLC5A8启动子区高甲基化的食管癌样本中存在甲基转移酶( DNMT1)的高频率表达, DNMT1参与维持甲基化;而DNMT3a, DNMT3b与SLC5A8启动子区高甲基化无关,二者参与从头甲基化。针对甲基转移酶尤其是DNMT1的表达调节,可能是改变这一地区食管癌甲基化表型的重要靶点。五.食管癌肿瘤组织中存在全基因组低甲基化水平的异常现象。六.SLC5A8有可能成为食管癌早期诊断的重要指标以及今后基因治疗的新的重要靶点。综上所述,本课题检测了抑癌基因SLC5A8在食管癌组织、Barrett食管中的表达及甲基化状态;食管癌患者术前、术后血浆中该基因的甲基化状态变化;甲基转移酶与该基因甲基化状况的相关性及食管癌全基因组甲基化的特点。从表观遗传学的角度分析了抑癌基因SLC5A8启动子区域甲基化与食管癌发生、发展的关系。进一步结合CIMP的检测,有利于我们揭示食管癌表观遗传学的特点,为今后表观遗传学在食管癌的早期诊断、治疗效果的监测及预后判断等方面的应用提供理论依据。

全文目录


一、摘要  6-19
  （一） 中文摘要  6-12
  （二） 英文摘要  12-19
二、文献综述  19-41
  （一） 综述  19-35
  （二） 参考文献  35-41
三、正文  41-91
  （一） 前言  41-43
  （二） 论文一 抑癌基因 SLC5A8 在食管癌、癌旁组织及正常食管粘膜中的表达情况  43-53
    材料与方法  44-47
    结果  47-48
    讨论  48-50
    结论  50-51
    参考文献  51-53
  （三） 论文二 SLC5A8 基因在食管癌、Barrett 食管及正常食管粘膜中的甲基化状态差异性分析  53-65
    材料与方法  54-57
    结果  57-60
    讨论  60-62
    结论  62-63
    参考文献  63-65
  （四） 论文三 SLC5A8 基因在食管癌患者术前、术后血浆中的甲基化状态差异性分析  65-74
    材料与方法  66-67
    结果  67-68
    讨论  68-71
    结论  71-72
    参考文献  72-74
  （五） 论文四 食管癌组织中甲基转移酶的表达及其与 SLC5A8 甲基化的关系  74-86
    材料与方法  74-76
    结果  76-79
    讨论  79-82
    结论  82-83
    参考文献  83-86
  （六） 论文五 大连地区食管癌全基因组甲基化的特点  86-91
    材料与方法  86-87
    实验结果  87-88
    讨论  88-89
    结论  89-90
    参考文献  90-91
四、附录  91-93
五、致谢  93

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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