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水稻转Bt基因对稻田土壤光合碳固定和微生物多样性的影响研究

作　者: 刘微
导　师: 陈英旭
学　校: 浙江大学
专　业: 环境工程
关键词: 转Bt基因水稻产物分配 13C 土壤有机碳变性梯度凝胶电泳(DGGE) 磷脂脂肪酸(PLFA)
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

近年来，随着转Bt基因植物的大量环境释放，转基因作物的生态安全问题越来越受到人们的关注与重视。尤其外源性基因(包括目的基因、标记基因和启动子等)的插入打乱了原有的基因网络，可能引起转基因作物的生理生化过程或光合产物代谢途径的改变，并由此导致以根系分泌物为底物和能源的微生物种群结构和活性变化，从而对农田土壤质量造成负面影响。本研究针对当前转Bt基因植物农田生态安全风险评价中关注的主要问题，以转Bt基因水稻“克螟稻”和亲本水稻“秀水11”为试材，通过(13)~C稳定态同位素脉冲标记技术，阐明了转Bt基因克螟稻及其亲本各器官(根、茎、叶)光合产物瞬时分配的差异以及水稻转Bt基因对土壤有机碳固定和微生物种群结构多样性的影响。在此基础上通过田间小区试验，对比杀虫剂施用和转Bt基因水稻种植对水稻根际微生物群落结构多样性的影响。研究结果为“克螟稻”等转Bt基因水稻大规模释放的农田土壤生态安全风险性评价提供了重要依据，并为同类研究提供了可借鉴的研究方法。具体研究结果如下：以克螟稻和亲本稻秀水11为研究对象，在温室条件下探讨了水稻不同生育期旗叶光合作用及其相关酶活性的变化。发现转Bt基因促进水稻拔节期和抽穗期旗叶光合速率和叶绿素含量显著升高。成熟期转Bt基因水稻与亲本水稻旗叶各生理指标无显著性差异。表明外源Bt基因的插入会引发水稻生长过程中光合生理特性的显著性变化，这种变化对农田土壤生态风险性影响有待进一步研究。基于转Bt基因对水稻光合特性的显著影响，应用(13)~C稳定态同位素脉冲标记技术分析了水稻转Bt基因对植物生长过程光合产物固定、分配及其根际活性微生物种群结构多样性的影响。结果表明，随着水稻生长，植物地上部分固定(13)~C的含量逐渐升高，而地下部分和土壤微生物中固定的(13)~C含量呈缓慢降低；苗期、拔节期和抽穗期转Bt基因克螟稻与亲本水稻叶片中(13)~C含量呈现显著性差异(P＜0．05)，然而在水稻生长的成熟期未观察到两者之间的显著性差异；苗期、拔节期和抽穗期，转Bt基因水稻根际革兰氏阳性菌(G~+)代表性脂肪酸含量显著低于其亲本水稻(P＜0．05)，革兰氏阴性菌(G~-)代表性脂肪酸含量则明显高于其亲本水稻(P＜0．05)，但在成熟期，两种水稻根际之间G~+、G~-以及磷脂脂肪酸总含量未呈现显著性差异(P＞0．05)；此外，在水稻生长的整个过程中，转Bt基因对水稻根际土壤真菌和放线菌代表性磷脂脂肪酸含量无显著性影响(P＞0．05)。总体而言，两种水稻瞬间光合产物优先进入根际革兰氏阳性菌(16：0)，真菌(cl8：2ω6)和革兰氏阴性菌(cl8：1)中。结果表明，crylAb基因的插入对苗期、拔节期和抽穗期水稻光合产物的分配以及根际细菌种群结构具有显著性影响，但这种影响并不持续到成熟期。以(13)~C标记的转Bt基因和亲本稻秸秆为试材，在温室条件下，通过秸秆还土试验探讨水稻转Bt基因对土壤有机碳固定效应的影响。结果发现，秸秆添加可显著提高淹水土壤甲烷和二氧化碳的排放通量。水稻根际微环境对秸秆的降解具有显著性的促进作用，秸秆降解过程中根际土壤有机碳(SOC)、溶解性有机碳(DOC)、微生物量碳(MBC)含量以及甲烷和二氧化碳排放速率均显著高于非根际土壤；与亲本水稻秸秆降解相比，水稻转Bt基因对根际和非根际区域秸秆的降解、土壤有机碳、溶解性有机碳和微生物量碳含量以及甲烷和二氧化碳的排放通量无显著性影响。变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱及其主成份(PCA)分析表明，水稻秸秆的添加对淹水土壤和水稻根际土壤产甲烷古菌的种群结构多样性具有一定的影响，但水稻转Bt基因则对淹水土壤和水稻根际产甲烷古菌没有显著性影响(P＞0．05)。通过田间试验，对比分析了水稻转Bt基因和杀虫剂施用对稻田土壤微生物学活性和根际细菌种群多样性的影响。结果发现水稻生长过程中根际土壤生物学活性发生显著性变化(P＜0．05)，但转Bt crylAb基因和三唑磷杀虫剂的施用均未对水稻根际土壤磷酸酶活性、脱氢酶活性、厌氧呼吸强度和产甲烷活性造成显著性影响(P＞0．05)。而水稻不同生长时期对水稻根际土壤微生物学活性有显著性影响(P＜0．05)。PCR-DGGE分子指纹图谱分析表明，三唑磷杀虫剂施用对拔节期和抽穗期水稻根际土壤细菌群落结构多样性具有显著性影响(P＜0．05)，而水稻转Bt基因对水稻生长过程中根际土壤细菌群落结构多样性没有显著性影响(P＞0．05)。由此可以推断，转Bt基因抗虫水稻对农田土壤细菌群落多样性影响风险较小或无风险。

全文目录

致谢  6-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-18
图表索引  18-20
INDEX OF FIGURES AND TABLES  20-23
缩略语  23-24
第一章绪论  24-56
  1.1 Bt基因及其在转基因抗虫作物中的研究进展  26-31
    1.1.1 Bt杀虫蛋白及其杀虫机理  26-28
    1.1.2 转Bt基因作物的研究和发展  28-31
  1.2 转基因作物安全性评价研究  31-43
    1.2.1 转基因植物的食品安全性  32-34
    1.2.2 转基因植物的环境安全性  34-43
  1.3 转Bt基因对植物生理特征影响研究  43-48
    1.3.1 转Bt基因对植物生理学性状的影响  43-45
    1.3.2 植物体养分循环的研究方法和试验技术  45-48
  1.4 转基因作物残茬降解对土壤有机碳固定和微生态系统的影响  48-52
    1.4.1 转基因对作物残茬降解和土壤碳固定的影响  48-51
    1.4.2 转基因作物残茬降解对土壤微生态系统的影响  51-52
  1.5 本论文研究的立项依据及研究意义  52-54
  1.6 研究内容及拟解决的关键问题  54-56
    1.6.1 研究内容  54
    1.6.2 拟解决的关键问题  54-56
第二章水稻转Bt基因对植株光合生理特性的影响  56-68
  2.1 引言  56
  2.2 材料与方法  56-59
    2.2.1 供试品种  56
    2.2.2 试验设计和管理  56-57
    2.2.3 相关生理指标测定  57-59
    2.2.4 数据处理与统计分析  59
  2.3 结果与讨论  59-66
    2.3.1 水稻转Bt基因对功能叶片光合作用的影响  59-60
    2.3.2 水稻转Bt基因对功能叶片叶绿素含量的影响  60-62
    2.3.3 叶绿素含量与净光合速率的关系  62
    2.3.4 水稻转Bt基因对光合酶活性的影响  62-66
  2.4 本章小结  66-68
第三章水稻转Bt基因对植株光合产物分配的影响  68-84
  3.1 引言  68-69
  3.2 材料与方法  69-73
    3.2.1 供试材料  69
    3.2.2 实验设计和管理  69-70
    3.2.3 ~(13)C脉冲标记  70-71
    3.2.4 水稻根际土壤总有机碳及δ~(13)C的测定  71
    3.2.5 磷脂脂肪酸(PLFA)的提取与测定  71-72
    3.2.6 数据处理与统计分析  72-73
  3.3 结果与讨论  73-81
    3.3.1 水稻转Bt基因对植株生物量的影响  73-74
    3.3.2 水稻转Bt基因对植株光合产物分配的影响  74-75
    3.3.3 水稻转Bt基因对瞬时光合产物在根际土壤及微生物中分配的影响  75-81
  3.4 本章小结  81-84
第四章水稻转Bt基因对秸秆降解特征的影响  84-110
  4.1 引言  84-86
  4.2 材料与方法  86-92
    4.2.1 实验材料及其预处理  86-87
    4.2.2 实验设计和管理  87-88
    4.2.3 土壤样品的采集和测定  88-89
    4.2.4 气体样品采集和测定  89-90
    4.2.5 土壤样品中产甲烷微生物PCR-DGGE分析  90-91
    4.2.6 数据统计与分析  91-92
  4.3 结果与讨论  92-109
    4.3.1 秸秆的养分及化学成分  92-93
    4.3.2 转Bt基因对水稻根际、非根际秸秆降解特性的影响  93-101
    4.3.3 转Bt基因对水稻根际、非根际秸秆降解过程中CH_4和CO_2排放量的影响  101-105
    4.3.4 转Bt基因对水稻根际、非根际秸秆降解中产甲烷古菌多样性的影响  105-109
  4.4 本章小结  109-110
第五章转Bt基因及杀虫剂施用对水稻根际微生物多样性的影响  110-126
  5.1 引言  110-112
  5.2 材料与方法  112-117
    5.2.1 实验设计  112-113
    5.2.2 取样时间及方法  113
    5.2.3 土壤生物学活性测定  113-114
    5.2.4 水稻根际总细菌多样性PCR-DGGE分析  114-116
    5.2.5 数据分析  116-117
  5.3 结果与讨论  117-125
    5.3.1 转Bt基因和杀虫剂施用对水稻根际土壤生物学活性的影响  117-121
    5.3.2 转Bt基因和杀虫剂施用对水稻根际总细菌多样性的影响  121-125
  5.4 本章小结  125-126
第六章研究结论、创新点及展望  126-130
  6.1 研究结论  126-128
    6.1.1 水稻转Bt基因对光合生理特征的影响  126
    6.1.2 水稻转Bt基因对光合产物分配的影响  126-127
    6.1.3 水稻转Bt基因对秸秆降解特征的影响  127
    6.1.4 转Bt基因及杀虫剂施用对水稻根际土壤微生物多样性的影响  127-128
  6.2 主要创新点  128
  6.3 展望  128-130
参考文献  130-148
作者简历及在学期间所取得的科研成果  148-149

水稻转Bt基因对稻田土壤光合碳固定和微生物多样性的影响研究

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