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子痫前期相关miRNA-miR-18a的功能研究

作　者: 杨洋
导　师: 尹国武；朱晓明
学　校: 第四军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子痫前期 微小RNA 胎盘 雌激素受体α 血浆雌二醇水平
分类号: R714.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


子痫前期(pre-eclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病,发病率高,临床症状严重,它是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。导致PE产生的原因众说纷纭,其中多因素所致滋养细胞功能障碍而引起的胎盘功能异常和血管重铸不足可能是主要原因[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类非编码小分子RNA,它在基因表达调控领域中起着重要作用[2]。新近研究表明[3],多种miRNA可在人胎盘组织中特异表达,其特有的基因调控功能可能与PE发病密切相关,其中miR-18a在PE孕妇胎盘组织中病理性低表达,并且初步预测出其靶基因为雌激素受体α(estrogen receptor alpha , ERα/ER1)。另有研究发现[4]miR-18a可抑制ERα的表达而促进肝癌细胞的增殖,明确了二者之间的靶向调节关系。而雌激素受体ER作为维持妊娠的重要性激素-雌二醇(Estradiol, E2)的功能实现中枢,可能与PE发病有关[5]。目前,国内外尚无PE相关miRNA及其靶基因与疾病发生相关性研究—miRNA与疾病相关的功能研究这一序列性研究文献报道。因此,有必要深入研究PE相关miRNA具体参与疾病发生发展过程的机制,为研究PE的发病机理提供新的依据和线索。目的1.了解PE相关miR-18a的靶基因ERα在正常胎盘与PE胎盘组织中是否存在差异表达,以及通过ERα发挥效应的雌二醇水平在正常孕妇与PE孕妇血浆中是否存在差异,进一步验证miR-18a与其靶基因ERα与PE发病的相关性。2.了解miR-18a对人滋养细胞功能的调控作用,以明确miR-18a在PE的发生发展过程的具体相关作用。方法1.应用TargetScan等六种miRNA靶基因预测软件再次验证miR-18a与其靶基因ERα之间的靶向调控关系。2.采用电化学发光全自动免疫分析系统检测正常足月孕妇组和PE孕妇组血浆中雌二醇水平;逆转录-聚合酶链反应技术(Reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR )和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)SP法检测21例正常足月妊娠胎盘组织中(对照组)和23例PE病理性胎盘组织中(PE组)ERα在mRNA水平的表达及细胞学定位差异。免疫印记(Western-blot)技术检测对照组和PE组胎盘组织中ERα在蛋白水平的表达。3.采用miRNA过表达与抑制技术在人滋养细胞肿瘤细胞系(JEG-3)中,过表达与抑制miR-18a,RT-PCR与Western-blot技术检测在人滋养细胞系中miR-18a与其靶基因ERα的表达水平,验证miR-18a与其靶基因ERα之间在mRNA和蛋白水平的负性靶向调控关系。4.在JEG-3细胞中过表达与抑制miR-18a,采用流式细胞术及Tran-swell小室技术检测JEG-3细胞增殖、凋亡和浸润能力的变化。结果1.应用六种靶基因预测软件并取交集,其中四种软件结果证实miR-18a与其靶基因ERα之间的靶向调控关系,与文献报道结果相符[6]。2.血浆激素水平检测显示正常孕妇组血浆中雌二醇水平明显高于PE孕妇组(P<0.05);免疫组织化学检测结果显示两组胎盘组织中均有ERα阳性表达,PE组ERα在细胞滋养细胞的细胞质内或细胞核内的阳性表达率高于正常孕妇组(P < 0.05)。RT-PCR结果显示正常孕妇组和PE孕妇组均有ERα表达,对比显示PE组ERα表达高于正常孕妇组(P < 0.05)。Western-blot结果显示ERα在蛋白水平的表达PE组高于正常孕妇组(P < 0.05)。3.在人滋养细胞肿瘤细胞系(JEG-3)中,过表达与抑制miR-18a后,RT-PCR结果显示转染后JEG-3细胞中miR-18a的表达受调控后升高和降低显著;ERαmRNA水平表达在转染前后差异显著(P < 0.05),受miR-18a负性调控显著;Western-blot结果显示ERα在蛋白水平的表达也受到miR-18a的负性调控。4.流式细胞技术检测结果显示,过表达与抑制miR-18a后,各实验组与对照组比较细胞的增殖能力无明显差异(P>0.05 );降调节miR-18a的表达可明显增加细胞的凋亡率(P < 0.05);细胞浸润实验发现,降调节miR-18a的表达可明显降低JEG-3细胞的侵袭能力(P < 0.05)。结论1. PE孕妇胎盘组织中ERα在mRNA和蛋白水平较正常孕妇表达增高,而PE孕妇血浆中雌二醇较正常孕妇呈降低水平,ERα病理性高表达与血浆中较低雌二醇水平呈负相关,提示PE病理状态下体内较低水平的雌二醇水平可能导致了ERα的代偿性增多;而组织细胞学检查定位于胎盘绒毛细胞滋养细胞、绒毛毛细血管管壁细胞和绒毛间质纤维组织成纤维细胞的ERα作为雌激素功能实现的介导中枢,可能通过与雌激素的相互介导作用而参与了PE的发生、发展。2.实验结果显示ERα为miR-18a的作用靶点,而在mRNA和蛋白水平miR-18a均对ERα有着明显的负性调控作用。3.降调节miR-18a的表达可以增加JEG-3细胞的凋亡率,降低其侵袭能力;因此,在PE胎盘中病理性低表达的miR-18a可能通过其对滋养细胞的细胞功能影响从而参与了PE的发病过程,为基因治疗在子痫前期疾病中的应用奠定了一定的理论与实验基础。

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学 > 病理妊娠（异常妊娠）
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