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耐旱野生大豆MicroRNA的鉴定与表达分析

作　者: 陈锐
导　师: 张辉
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: MicroRNA 野生大豆 耐旱 高通量测序 Solexa
分类号: S565.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


小RNA(MicroRNA,miRNA)在转录后基因沉默过程中扮演重要角色,它可以介导具有同源序列的靶基因miRNA裂解或抑制其翻译。野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆改良的重要遗传资源,对其开展miRNA的鉴定与功能研究,将进一步促进野生大豆资源在栽培大豆育种中的利用。本研究利用小分子RNA文库串联测序、Solexa高通量测序等技术,对抗旱野生大豆资源S101中的小分子RNA进行分离、鉴定,从中获得与抗旱相关的miRNA;结合靶基因裂解位点验证实验,通过构建miRNA表达载体、转化拟南芥,对miRNA的功能进行初步研究。本研究在野生大豆miRNA的分离、鉴定与功能分析等方面获得了大量重要信息,进一步拓宽了对植物miRNA的理解和认识。详细研究结果如下:1、小分子RNA文库串联测序数据分析通过构建小分子RNA文库并串联测序,共获得2,880条小分子RNA序列,序列分布图显示19~24 nt的序列为1,347条(1,022条单一序列),占46.8%;21nt小分子RNA表达丰度最高,占334条(223条单一序列)。①与已知miRNA(miRBase_mature, Release 11.0)同源比对发现,有15条小RNA序列与植物已知miRNA一致或同源(≤2bp mismatches),其中14条序列与栽培大豆miRNA同源。它们分别隶属于8个保守家族:miR156、miR159、miR160、miR167、miR168、miR171、miR319和miR396。除了miR171家族以外,其他7个保守家族均已在大豆中报道;②与栽培大豆EST数据库分析发现, 15个保守miRNA候选者中有9个可以在27条大豆EST序列中找到完全匹配的位点,其中gso-miR167对应的两条前体序列与大豆已知miR167前体序列不同,但能形成特征性的发卡环结构,说明miR167可能有两个新的候选者及其前体;③在预测分析新miRNA的过程中发现,442条候选小RNA序列中有74条可以在407条大豆EST序列中找到完全匹配的位点,其中9条小RNA序列(8个家族)对应的22条EST序列具备miRNA前体特征;④预测发现的15个保守miRNA和9个新miRNA候选者的长度均在20-22nt之间,多数5’端为尿嘧啶,符合miRNA的典型特征。2、小分子RNA文库高通量测序数据分析新一代测序技术为miRNA的分离、鉴定提供了高效的分析平台。利用Solexa高通量序列测定仪,分析了野生大豆小分子RNA文库,共获得高质量序列3,161,992条(1,282,308条单一序列)。①与大豆基因组序列信息分析表明,12,734条小RNA对应的基因组序列能通过mFold和mirCheck检测,具备miRNA的特征性的发卡环结构,由此可见miRNA群体的复杂程度。经过进一步的复杂分析和严格筛选,共得到141个保守的miRNA和171个新miRNA;②171个新miRNA中,53个新miRNA共预测到206个靶基因,其功能涉及到植物生长发育和环境响应的各个方面;③分析结果还发现许多值得深入研究的现象。例如:在植物中普遍存在的miR159和miR319前体中发现了串联miRNA的现象、某些保守miRNA星号链的大量存在、大豆miRNA前体的正负链匹配等。3、miRNA功能的初步分析对小分子RNA文库串联测序获得的8个保守和8个新的miRNA家族进行了Nothern杂交、靶基因预测、转化拟南芥等初步的功能分析。①Nothern杂交验证表明,8个保守和8个新的miRNA家族在野生大豆正常生长和干旱胁迫情况下都有表达,但表达丰度各异。其中,4个保守miRNA和3个新miRNA在干旱胁迫前后表现为不同程度的丰度变化。miR160、miR167、miR319、miR396和gso-miR2在干旱胁迫后明显下调表达;gso-miR1和gso-miR6干旱胁迫后上调表达。针对8个新发现的miRNA家族的组织特异性分析表明,所有miRNA在正常生长的野生大豆的根、茎、叶中的表达丰度均各有特点。多数表现为高度的组织特异性表达,并且倾向于在根中相对高丰度表达。②靶基因预测分析发现,7个新的miRNA家族对应的32个靶基因多数为功能上已注释的抗病或抗性蛋白。靶基因裂解位点验证实验表明,其中gso-miR7对应的功能未知基因TC233731和gso-miR8对应的TC225607(R 9蛋白)的裂解位点与预测一致。③通过构建miRNA表达载体、转化拟南芥,对gso-miR5、gso-miR6、gso-miR7和gso-miR8进行了miRNA功能的初步研究,发现gso-miR8对应的T1代植株表现出早开花的突变表型。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-13
第一章 绪论  13-41
  1.1 干旱是影响大豆产量的重要因素  13
  1.2 我国大豆产业形势严峻  13-14
  1.3 野生大豆是栽培大豆的天然基因库  14
  1.4 植物抗旱相关基因源研究进展  14-20
    1.4.1 功能蛋白  15-16
    1.4.2 转录因子  16-18
    1.4.3 信号分子  18-20
  1.5 MicroRNA 研究进展  20-40
    1.5.1 MicroRNA 的发现  21-22
    1.5.2 MicroRNA 与siRNA 的异同  22-23
    1.5.3 MicroRNA 的生物合成  23-27
    1.5.4 MicroRNA 生成的调控  27-28
    1.5.5 MicroRNA 的作用机制  28-29
    1.5.6 MicroRNA 的典型特征  29-31
    1.5.7 植物生长发育相关的MicroRNA  31-33
    1.5.8 植物逆境胁迫相关的MicroRNA  33-36
    1.5.9 MicroRNA 的研究方法  36-39
    1.5.10 MicroRNA 研究展望  39-40
  1.6 本研究的目的与意义  40-41
第二章 野生大豆干旱胁迫下小分子 RNA 文库的构建  41-59
  2.1 材料与方法  41-52
    2.1.1 野生大豆苗期抗旱筛选试验  41
    2.1.2 小分子RNA 文库的构建  41-47
    2.1.3 小分子RNA 文库的优化及串联测序  47-51
    2.1.4 Solexa 文库的构建及高通量测序  51-52
  2.2 结果与分析  52-58
    2.2.1 野生大豆苗期抗旱筛选试验  52
    2.2.2 小分子RNA 文库的构建  52-54
    2.2.3 小分子RNA 文库的优化及串联测序  54-57
    2.2.4 Solexa 文库测序结果  57-58
  2.3 讨论  58
  2.4 结论  58-59
第三章 野生大豆干旱胁迫相关 MicroRNA 的生物信息学分析  59-83
  3.1 材料与方法  59-62
    3.1.1 小分子RNA 文库的生物信息学分析  59-60
    3.1.2 Solexa 文库的生物信息学分析  60-62
  3.2 结果与分析  62-80
    3.2.1 小分子RNA 文库的生物信息学分析  62-67
    3.2.2 Solexa 文库的生物信息学分析  67-80
  3.3 讨论  80-82
  3.4 结论  82-83
第四章 野生大豆干旱胁迫相关 MicroRNA 的鉴定与功能分析  83-108
  4.1 材料与方法  83-98
    4.1.1 Northern 杂交验证实验  83-85
    4.1.2 预测靶基因裂解位点验证实验（5’-RACE）  85-92
    4.1.3 人工构建MicroRNA 前体转化拟南芥实验  92-98
  4.2 结果与分析  98-106
    4.2.1 Northern 杂交验证实验  98-101
    4.2.2 预测靶基因裂解位点验证实验（5’-RACE）  101-103
    4.2.3 人工构建MicroRNA 前体转化拟南芥实验  103-106
  4.3 讨论  106-107
    4.3.1 MiRNA 表达分析  106
    4.3.2 功能验证分析  106-107
  4.4 结论  107-108
第五章 全文结论  108-110
  5.1 野生大豆干旱胁迫相关MicroRNA 的克隆与分析  108
  5.2 野生大豆干旱胁迫相关MicroRNA 的鉴定与功能分析  108-109
  5.3 高通量测序小分子RNA 的分析结果（Solexa 文库）  109-110
参考文献  110-122
附录  122-123
致谢  123-124
作者简历  124

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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