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抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体的制备与初步应用研究

作　者: 别彩群
导　师: 杨冬华
学　校: 暨南大学
专　业: 内科学
关键词: 肝癌单链抗体二聚体噬菌体展示技术亲和力毕赤酵母特异性结合活性稳定性高分子纳米颗粒包封率载药量抑瘤性
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景和意义:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五常见的癌症,是我国癌症中的第二号杀手,全球50%以上的肝癌发生在我国。目前传统的治疗如外科手术及放化疗等没有理想的疗效。单链抗体(Single chain variablefragment,scFv)分子量小、穿透力强、体内半衰期短、免疫原性低并且具有亲本抗体相同的抗原结合能力,可能成为肝癌靶向治疗的理想载体。我们课题组采用噬菌体抗体展示技术成功筛选出1株特异性抗肝癌噬菌体scFv 4-16(GenBank:DQ640759),并对其进行了体外亲和力成熟及人源化改造,获得了具有较高亲和力和较低免疫原性的scFv。初步研究显示特异性抗肝癌scFv 4-16对肝癌细胞及肝癌组织抗原具有较好的特异性,拥有较好的研究开发和临床应用潜力。但scFv是单价抗体,仍存在着亲和力较弱、稳定性较差、体内清除过快、在大肠杆菌中分泌表达量过小等不足。因此,本研究重点构建亲和力高和稳定性好的抗肝癌单链抗体二聚体,并实现其在毕赤酵母中的高效表达,制备单链抗体二聚体纳米颗粒,观察其对体外肝癌细胞增殖的影响。为探讨单链抗体对肝癌的放射免疫显像诊断和靶向治疗价值提供依据。第一章抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体的构建、表达与鉴定目的:构建抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体,并在大肠杆菌中可溶性表达,鉴定其生物活性。方法:将我室构建的抗肝癌噬菌体scFvDM连接肽的长度从15个氨基酸残基缩短至3-5个,克隆至载体pCANTAB5E,转化感受态大肠杆菌TG1并测序,对测序正确的阳性克隆予辅助噬菌体感染,制备噬菌体抗体,检测其相对亲和力,将亲和力指数最高的噬菌体抗体在大肠杆菌HB2151中进行诱导可溶性表达,采用SDS-PAGE、Western blotting鉴定表达产物,并进行浓度及特异性检测。结果:测序结果显示成功构建三株抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体(scFv-3、scFv-4、scFv-5),其亲和力指数是亲本抗体的3.5-6倍。将亲和力指数最高的一株二聚体(scFv-5,命名为BDM3)在大肠杆菌HB2151中可溶性表达,通过SDS-PAGE和Western blotting检测到目标蛋白带;ELISA结果显示:表达产物具有与肝癌细胞特异性结合活性,与胎肝细胞、胃癌细胞等均无交叉反应,但抗体表达的量较低,浓度仅为100μg/L菌液,不能满足后续的研究需要。结论:成功构建了抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体基因,并获得可与肝癌细胞特异结合的高亲和力的抗肝癌单链抗体二聚体,为后续实现抗体在酵母中大量表达奠定基础。第二章抗肝癌单链抗体二聚体在酵母中表达及其生物活性的鉴定目的:实现抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中高效表达,并鉴定所表达抗体的生物活性。方法:构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM3,转化感受态大肠杆菌DH5α,选择测序正确的阳性克隆进行扩增后,电转化酵母细胞,表达抗体二聚体,对表达抗体进行纯化、二聚体分子量及形成比例、浓度检测,并鉴定其对肝癌细胞的结合活性和稳定性,免疫组化检测二聚体对肝癌组织抗原的特异性。结果:测序显示成功构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM3,表达96小时抗体收获量最大,纯化后的抗体经凝胶过滤色谱检测,二聚体的分子量为62kD,二聚体形成比例为92%。二聚体表达量为30mg/L菌液,为大肠杆菌的300倍。抗肝癌单链抗体二聚体BDM3与三种肝癌细胞结合,而与正常肝细胞不结合,结合效价为1:128。稳定性实验证实抗肝癌单链抗体二聚体BDM3在37℃孵育16小时后与肝癌细胞的结合活性下降到50%,孵育48小时后完全失去结合活性,具有很好的稳定性。免疫组化显示二聚体与肝癌组织结合的阳性率比肝硬化、胃癌、肠癌、正常肝组织高,差异有统计学意义。结论:成功制备了高表达量、高特异性、较好的活性及稳定性的抗肝癌单链抗体二聚体BDM3,为制备免疫纳米颗粒及开展肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础。第三章免疫纳米颗粒制备、检测及其对肿瘤细胞增殖的影响目的:制备高分子免疫纳米颗粒,并观察其对肝癌细胞增殖的影响。方法:采用离子交联的方法,以壳聚糖水溶性衍生物多糖为基材,将已获得的抗肝癌单链抗体二聚体制备成免疫纳米颗粒,检测纳米颗粒的表征、包封率及载药量,并通过MTT法观察免疫纳米颗粒对肝癌细胞株增殖的影响。结果:制备粒径为100-200nm的抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒,最佳包封率为53%,载药量为每毫克75微克抗体二聚体,高分子纳米颗粒对肿瘤细胞无毒性,但抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒显示较好的抗肿瘤作用,其对肝癌细胞的抑制率为34%左右,且有浓度依赖性。结论:成功制备了抗肝癌单链抗体二聚体高分子纳米颗粒,初步应用具有抑瘤性,为下一步开展体内肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-11
绪论  11-17
  1 原发性肝癌的治疗现状  11-12
  2 单链抗体的优缺点及改造策略  12-14
  3 基因工程抗体的表达  14
  4 基因工程抗体在肿瘤的靶向诊断和治疗中的应用  14-15
  5 本课题研究内容  15-17
第一章抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体的构建、表达与鉴定  17-40
  第一节前言  17-19
  第二节实验材料和方法  19-30
  第三节结果  30-37
  第四节讨论  37-40
第二章抗肝癌单链抗体二聚体在酵母中表达及其生物活性的鉴定  40-64
  第一节前言  40-42
  第二节实验材料和方法  42-51
  第三节结果  51-59
  第四节讨论  59-64
第三章免疫纳米颗粒的制备及对其肝癌细胞株增殖的影响  64-77
  第一节前言  64-66
  第二节实验材料和方法  66-69
  第三节结果  69-74
  第四节讨论  74-77
全文总结及展望  77-78
全文创新之处  78-79
参考文献  79-86
缩写词表(中英文对照)  86-87
在校期间发表的论文及参编专著  87-88
在校获得奖励及荣誉  88-89
致谢  89

抗肝癌噬菌体单链抗体二聚体的制备与初步应用研究

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