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IL-11调控中子辐射肠上皮细胞损伤的ERK和PI3K/Akt信号转导机制研究

作　者: 王瑞娟
导　师: 彭瑞云
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 中子肠上皮细胞 IL-11 ERK PI3K/Akt Bax/Bcl-2
分类号: R818
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的和意义中子辐射肠损伤重、难恢复,且目前尚无防治良策。本课题组前期研究发现,IL-11可减轻中子辐射对肠道损伤,促进肠上皮再生,其防治机制与IL-11刺激肠上皮细胞IL-11受体表达上调并激活Jak/STAT信号转导通路有关。但有关IL-11诱导的ERK及PI3K通路在中子辐射肠上皮细胞损伤发生发展中的变化以及通路之间的相互作用、IL-11对Bax和Bcl-2的调节研究尚属空白。在中子辐射诱发的损伤中,多种基因表达的变化可能发挥重要作用,基因芯片技术可高通量地筛选损伤后差异表达基因谱,并为深入探讨IL-11信号转导机制提供线索。为此,本研究对上述问题进行探讨,为阐明中子辐射肠道损伤及IL-11调控的分子机制,并为寻找新的防治措施奠定理论基础。材料与方法168只BALB/c二级雄性小鼠,分别经3Gy中子和10Gyγ射线照射,中子照后腹腔注射500μg/kg的rhIL-11,每日1次,连用5 d,于照后6 h、1 d、2 d、3 d和5 d活杀取材。同时采用4Gy中子和10Gyγ射线照射IEC-6细胞,并于照射前12 h或照射后即刻给予100ng/ml的rhIL-11,于rhIL-11处理前12 h分别加入10μM U0126或LY294002。采用基因芯片、RT-PCR、HE染色、MTT、流式细胞术、Hoechst染色、免疫组化、免疫印迹和图像分析等技术,研究中子照射后小鼠空肠组织差异表达基因及肠道病理形态的变化;探讨IL-11及U0126和LY294002对小鼠肠道病理形态、IEC-6细胞增殖活力及凋亡和坏死率的影响以及IEC-6细胞Raf-1、MEK1/2、ERK1/2、PI3K、PDK1、PTEN和Akt表达及活化的影响。实验结果1.小鼠死亡情况及小肠病理改变:(1)3Gy中子照射后小鼠于3~5 d内全部死亡,并出现腹泻症状,体重进行性下降;照射后6 h~3 d,肠黏膜大面积坏死脱落,绒毛上皮细胞稀疏、排列紊乱,细胞肿胀;隐窝细胞数量急剧减少,伤后2 d时隐窝中细胞少见、结构破坏,绒毛上皮及基部细胞浆出现嗜酸性变,核浓缩及核碎片形成,照后3 d偶见隐窝细胞再生;IL-11治疗组照后3~5 d小鼠存活曲线右移,腹泻率降低,治疗后3 d隐窝再生较明显,肠绒毛上皮细胞数目较多。2.小鼠小肠差异表达基因改变:3Gy中子照射后6 h,小鼠空肠组织中存在608个差异表达的基因,其中上调的有277个,下调的有331个,差异基因涉及细胞的增殖与凋亡、MAPK和PI3K/Akt等多条信号通路等。3. IEC-6细胞生物学行为的改变:(1)10Gyγ射线照射后6 h,IEC-6细胞凋亡和坏死率增加、增殖活力下降、细胞周期阻滞;IL-11处理组凋亡和坏死率下降。(2)4Gy中子照射后6 h,IEC-6细胞肿胀变圆、凋亡和坏死率增加、增殖活力下降;照射后24 h,IEC-6细胞凋亡和坏死率无明显变化,增殖活力下降。IL-11处理组,其形态较好、增殖活力升高、凋亡和坏死率下降。4. IEC-6细胞ERK信号通路的改变及U0126对其生物学行为影响:(1)10Gyγ射线照射后6~24h,IEC-6细胞Raf-1表达和活化及MEK1/2活化升高,ERK1/2活化减弱;与照射组比较,IL-11处理组于照射后5~15min可增加Raf-1和MEK1/2活性,其余时间点改变不明显,照射后6 h抑制ERK1/2活化。(2)4Gy中子照后6~24 h,Raf-1表达和活化及MEK1/2活化无明显变化,ERK1/2表达和活化升高;与照射组比较,IL-11处理组照后6 h,Raf-1表达变化不明显,照后6~24 h,MEK1/2活化升高,IL-11在照后6 h抑制ERK1/2表达及活化,照后24 h增加ERK1/2表达及活化。(3)IL-11处理前应用U0126处理IEC-6细胞,4Gy中子照射后6~24 h,其增殖活力较IL-11处理组下降,凋亡和坏死率变化不明显。5. IEC-6细胞PI3K/Akt信号通路的改变及LY294002对其生物学行为影响:(1)10Gyγ射线照射后6 h,IEC-6细胞PI3K表达和Akt活化减弱,Akt表达、PDK1及PTEN活化增加;IL-11处理组PI3K表达和Akt活化增加,Akt表达、PDK1及PTEN活化减弱。(2)4Gy中子照后6 h,IEC-6细胞PI3K表达减少,24 h恢复;照后6~24 h,PDK1及PTEN活化增加,Akt活化减弱;IL-11处理组照后6~24 h,PI3K表达和Akt活化增强,PDK1和PTEN活化减弱。(3)IL-11处理前应用LY294002处理IEC-6细胞,4Gy中子照射后6~24 h,其增殖活力较IL-11处理组下降,凋亡和坏死率变化增加。6. ERK和PI3K/Akt信号通路间的相互调控:(1)U0126处理组IEC-6细胞在照后6~24 h,ERK1/2表达和活化较IL-11处理组无明显变化,但PDK1及Akt活化均增加。(2)LY294002处理组IEC-6细胞与IL-11处理组比较,照后6~24 h,Akt活化及ERK1/2的表达和活化均下降。7.小鼠小肠Bax和Bcl-2表达的改变:(1)Bax于正常小鼠小肠绒毛上皮细胞呈颗粒状阳性,于隐窝细胞呈弱阳性;3Gy中子和10Gyγ线照射后6 h~3 d,Bax表达显著增强;3Gy中子照射后应用IL-11治疗,Bax表达于照后3 d减弱。(2)Bcl-2于正常小鼠肠绒毛和隐窝细胞浆呈弱阳性表达;3Gy中子照射后6 h~3d,Bcl-2表达无明显变化;10Gyγ线照射后6 h~3 d,Bcl-2表达升高;3Gy中子照射后应用IL-11治疗,Bcl-2表达于照后3 d升高。结论1.中子照射可致小鼠空肠多靶点的损伤,涉及包括PI3K/Akt和MAPK在内的多条通路。2.中子照射后肠上皮细胞内ERK1/2持续激活,IL-11对其活化呈先抑制后激活的波动趋势,提示ERK在中子辐射肠上皮细胞损伤与修复的不同阶段发挥不同的作用。3.中子照射时,PI3K/Akt通路活化受抑制,IL-11可通过促进其激活发挥细胞保护作用。4.中子和γ射线对肠上皮细胞ERK和PI3K/Akt的影响不同,可能是二者致伤差异的分子机制。5. IL-11调控中子辐射肠上皮细胞时,ERK和PI3K/Akt通路在IEC-6细胞内可能通过一个反馈环路联系:ERK1/2的持续激活反馈性抑制了PI3K/Akt的活性,IL-11对ERK的抑制作用,则协同IL-11促进了PI3K/Akt途径活性的上调;ERK1/2的活性受PI3K的调节而不依赖于MEK1/2。6.在中子辐射时,LY294002阻断IL-11对肠上皮细胞的保护作用较U0126更显著,提示ERK和PI3K/Akt通路在介导IL-11保护作用中地位不同,ERK主要与细胞的增殖有关,而PI3K/Akt则与细胞的增殖与死亡反应均有关。7.中子辐射肠道损伤时,IL-11可通过减小Bax/Bcl-2比值发挥保护作用。

全文目录

缩略词表  8-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-16
前言  16-24
  参考文献  21-24
第一部分中子辐射损伤后小鼠肠道差异基因筛选及 IL-11 治疗中子辐射肠道损伤模型的建立  24-43
  材料和方法  24-28
    一、实验动物及分组  24
    二、中子照射方法  24-25
    三、IL-11 给予方案  25
    四、小肠组织病理检查  25-26
    五、小鼠空肠组织差异基因筛选  26-27
    六、统计学处理  27-28
  结果  28-35
    一、小鼠体重的变化  28
    二、小鼠存活时间的改变  28-29
    三、小鼠整体行为和腹泻情况  29-30
    四、小鼠肠道损伤的病理变化  30-31
    五、中子照射后小鼠空肠组织差异表达基因的筛选  31-35
  讨论  35-40
    一、IL-11 治疗中子辐射肠道损伤模型的建立  36
    二、中子照射后小鼠空肠组织差异表达的基因  36-40
  结论  40
  参考文献  40-43
第二部分 ERK 通路在中子及γ线致肠上皮损伤中的变化及IL-11 对其调控研究  43-73
  材料和方法  43-53
    一、IEC-6 细胞培养  43-44
    二、rhIL-11 处理方法  44-45
    三、U0126 处理方法  45
    四、中子照射方法  45
    五、γ射线照射方法  45
    六、IEC-6 细胞分组  45-46
    七、细胞涂片制作  46
    八、倒置显微镜观察IEC-6 细胞形态的改变  46
    九、MTT 比色法检测细胞的增殖活力  46
    十、流式细胞术检测IEC-6 细胞的凋亡和坏死率  46-47
    十一、Hoechst 33258 染色观察细胞凋亡  47
    十二、流式细胞术检测IEC-6 细胞周期  47
    十三、Western Blot 检测 Raf-1、MEK1/2 和 ERK1/2 的表达及磷酸化  47-53
    十四、图像分析及定量方法  53
    十五、统计学处理  53
  结果  53-66
    一、IEC-6 细胞的形态学改变  53-54
    二、IEC-6 细胞增殖活力改变  54-55
    三、IEC-6 细胞凋亡和坏死率的改变  55-57
    四、IEC-6 细胞周期的变化  57-58
    五、IEC-6 细胞Raf-1 表达及活化的变化  58-59
    六、MEK1/2 活化的变化  59-61
    七、ERK1/2 表达及活化的变化  61-63
    八、MEK1/2 阻断剂U0126 对IEC-6 细胞损伤的影响  63-66
  讨论  66-70
    一、ERK 通路在中子和γ射线致肠上皮损伤中的变化及意义  66-68
    二、IL-11 对中子及γ线照射后IEC-6 细胞中ERK 通路的影响及意义  68-69
    三、U0126 对IL-11 保护IEC-6 细胞中子辐射损伤效应影响  69-70
  结论  70
  参考文献  70-73
第三部分 PI3K/Akt 通路在中子及 γ 线致肠上皮损伤中的变化及 IL-11 对其调控研究  73-88
  材料和方法  73-75
    一、IEC-6 细胞培养  73
    二、IEC-6 细胞的rhIL-11 处理方法  73
    三、IEC-6 细胞的LY294002 处理方法  73
    四、IEC-6 细胞中子和γ射线照射方法  73
    五、IEC-6 细胞分组  73-74
    六、MTT 比色法检测细胞增殖活力  74
    七、流式细胞术检测IEC-6 细胞凋亡和坏死率  74
    八、Western Blot 检测PI3K、PDK1、PTEN 和Akt 的表达及磷酸化  74
    九、图像分析及定量方法  74
    十、统计学处理  74-75
  结果  75-82
    一、IEC-6 细胞中PI3K 激酶表达的变化  75-76
    二、IEC-6 细胞中PDK1 活化的变化  76-77
    三、IEC-6 细胞中Akt 激酶表达和活化的变化  77-79
    四、IEC-6 细胞中PTE N 活化的变化  79-80
    五、LY294002 对IEC-6 细胞的影响  80-82
  讨论  82-86
    一、PI3K/Akt 通路在中子和γ射线致肠上皮损伤中的变化及意义  82-83
    二、IL-11 对中子及 γ 线照射后 IEC-6 细胞中 PI3K/Akt 通路的影响及意义  83-84
    三、LY294002 对IL-11 保护IEC-6 细胞中子损伤效应影响  84-86
  结论  86
  参考文献  86-88
第四部分 ERK 和 PI3K/Akt 通路在中子辐射肠上皮损伤中的交互调控作用研究  88-97
  材料和方法  88-89
  结果  89-92
    一、U0126 对PI3K/Akt 通路主要信号分子活化的影响  89-91
    二、LY294002 对ERK 通路核心激酶ERK1/2 表达和活化的影响  91-92
  讨论  92-94
    一、在 IL-11 调控中子辐射肠上皮损伤过程中，ERK 通路反馈性抑制PI3K/Akt 通路的活性  92-93
    二、在 IL-11 调控中子辐射肠上皮损伤过程中,PI3K/Akt 通路促进 ERK通路的活性上调  93-94
  结论  94-95
  参考文献  95-97
第五部分中子照射后小鼠小肠组织中 Bax, Bcl-2 表达变化及IL-11 对其调控研究  97-106
  材料和方法  97-99
    一、实验动物与分组  97
    二、中子和γ射线照射  97
    三、小鼠中子照射后IL-11 治疗  97
    四、小鼠肠道病理标本制作  97
    五、免疫组织化学（SP 法）检测Bax 和Bcl-2 的表达  97-99
    六、图像分析定量检测Bax 和Bcl-2 的表达  99
    七、统计学处理  99
  结果  99-102
    一、小鼠小肠组织中Bax 的表达变化  99-101
    二、小鼠小肠组织中Bcl-2 的表达变化  101-102
  讨论  102-104
  结论  104
  参考文献  104-106
全文结论  106-107
综述  107-119
  参考文献  113-119
在学期间以第一作者发表的论文目录及复印件  119-120
个人简历  120-121
致谢  121-122

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