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苹果早期落叶病生物防治关键技术研究及其田间应用

作　者: 陈亮
导　师: 陈五岭
学　校: 西北大学
专　业: 微生物学
关键词: 苹果早期落叶病 生物防治 枯草芽孢杆菌 巨大芽孢杆菌 抑菌多肽 发酵工艺优化 响应面分析 田间试验
分类号: S436.611
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 338次
引　用: 2次
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内容摘要


目前,苹果早期落叶病已成为我国苹果生产中最严重的病害之一,在我国各苹果主产区均有发生,且发病率逐年上升,直接影响苹果的产量和质量,危害巨大。本研究对广谱拮抗菌株分离筛选、菌株分类鉴定、拮抗菌株对病原菌的抑制作用、抑菌物质的分离纯化和研究、发酵工艺优化和田间防治等苹果早期落叶病生物防治关键技术进行了系统地研究,以期为苹果早期落叶病的生物防治提供理论依据和奠定应用基础,旨在探索一条绿色高效、可持续的苹果早期落叶病病害防治途径。采用稀释分离法从不同来源的11份样品中分离纯化得到细菌菌株173株,以8种植物病原菌为靶标、采用平板对峙法、以抑菌效果明显和菌株生长迅速为筛选标准,进行植物病害广谱拮抗菌株的筛选,共筛选得到广谱拮抗菌株20株,其中有7株菌株对苹果斑点落叶病病原菌（Alternaria alternata f.sp.Mali）和苹果褐斑病病原菌（Marssoninacoronaria（Ell Et Davis）Davis）均有明显抑制作用。然后以Alternaria alternata f.sp.Mali和Marssonina coronaria（Ell Et Davis）Davis为靶标、采用平皿叶片法,对7株广谱拮抗菌株进行苹果早期落叶病广谱拮抗菌株的复筛,复筛结果显示菌株BS24和菌株D4的抑制效果最好,病叶抑制率分别为100%和90.48%。结合传统细菌分类鉴定方法和16S rDNA序列分析对拮抗菌株BS24和D4进行分类鉴定,结果表明菌株BS24应为枯草芽孢杆菌和菌株D4应为巨大芽孢杆菌,Genbank登录号分别为GQ213991和FJ755786。系统研究了拮抗菌株BS24对病原菌的作用方式。菌株BS24可显著抑制Alternariaalternata f.sp.Mali、Marssonina coronaria（Ell Et Davis）Davis的菌丝生长,抑菌带宽度分别为9.5 mm和9.2 mm;可在苹果叶片上迅速定殖、占据生存空间,使病原菌无法在叶片上定殖,从而有效地阻断了病原菌对苹果叶片的侵染。菌株无细胞培养滤液同样可明显抑制病原菌的生长,对Alternaria alternata f.sp.Mali和Marssonina coronaria（Ell EtDavis）Davis的抑制率分别为85.48%和82.86%;可使病原菌菌丝生长畸形,出现扭曲变形、明显交联、部分部位断裂、细胞质聚集以及内含物外溢等现象;还可导致芽管生长畸形,明显抑制病原菌分生孢子的萌发。通过酸沉淀、甲醇抽提和RP-HPLC等步骤,分离得到抑菌物质BSP,经研究初步确定其为一个小分子抑菌多肽。BSP抑菌谱较广,对Alternaria alternata f.sp.Mali、Marssonina coronaria（Ell Et Davis）Davis、Phyllostictapirina、Bolyosphoma berengeriana、Fusarim oxysporium f.sp.Melonis、Glanerella cingulata、Alternaria alternata fries Keissler和Alternaria solani等病原真菌和Escherichia coli均具有抑菌活性,其中对Alternaria alternata f.sp.Mali、Marssonina coronaria（Ell Et Davis）Davis的EC50分别为5.03μg/mL和5.60μg/mL。BSP具有良好的热稳定性、pH稳定性和蛋白酶稳定性。菌株BS24可分泌胞外蛋白酶。综合考虑工业化生产要求,以发酵液活菌数为检测标准,从6种供试发酵培养基中选出初始发酵培养基。采用Plackett-Burman设计法、最陡爬坡试验、中心组合设计法进行进一步的优化,得到拟合良好的回归方程,R2=0.96。模型验证显示预测值与实测值之间具有较好的拟合性,预测模型可靠。未优化前发酵液活菌数为8.6×109 cfu/mL,优化后为15.08×109 cfu/mL,增加了75.35%。优化后发酵工艺为淀粉1.5g,黄豆粉2.16 g,酵母膏0.3 g,蔗糖0.5 g,尿素0.2 g,MnSO4 0.01 g,MgSO4 0.01 g,K2HPO4 0.2 g,蒸馏水100mL,pH 7.0,转速300 r/min,接种量7.8%。田间试验结果表明,拮抗菌剂三个不同浓度的处理均对苹果早期落叶病有较好的防治效果,拮抗菌剂原液、拮抗菌剂50倍液和拮抗菌剂100倍液防治效果分别为83.14%、79.21%和76.99%,均显著高于10%多抗霉素WP 1000倍的70.04%（p＜0.05）。供试拮抗菌剂在试验浓度范围内对供试果树无任何不良影响,使用安全。拮抗菌剂处理组果实感官评价、农药残留、重金属残留均符合国家无公害食品的要求。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-8
缩写词英汉对照  8-9
目录  9-14
引言  14-15
第一章 文献综述  15-30
  1 苹果  15-16
    1.1 苹果简介  15
    1.2 苹果产业  15-16
    1.3 苹果生产中的质量安全问题  16
  2 苹果早期落叶病  16-20
    2.1 概况  16-17
    2.2 主要病害  17-19
    2.3 苹果早期落叶病防治现状  19-20
  3 拮抗微生物研究进展  20-25
    3.1 拮抗微生物的种类  20-23
    3.2 拮抗微生物作用机理  23-25
  4 生防芽孢杆菌  25-30
    4.1 概况  25
    4.2 芽孢杆菌分泌的抑菌物质  25-30
第二章 苹果早期落叶病广谱拮抗菌株的分离筛选  30-40
  0 引言  30
  1 材料  30-32
    1.1 采集的样品  30-31
    1.2 供试植物病原菌  31
    1.3 培养基  31-32
    1.4 主要仪器  32
  2 方法  32-34
    2.1 细菌菌株的分离、纯化  32
    2.2 病原菌培养  32-33
    2.3 病原菌孢子悬液制备  33
    2.4 细菌培养  33
    2.5 拮抗菌株筛选  33
    2.6 苹果早期落叶病广谱拮抗菌株复筛  33-34
    2.7 数据分析  34
  3 结果与分析  34-37
    3.1 细菌菌株的分离、纯化  34
    3.2 植物病害广谱拮抗菌株筛选结果  34-36
    3.3 苹果早期落叶病拮抗菌株筛选结果  36-37
  4 结论与讨论  37-40
第三章 拮抗菌株的分类鉴定  40-49
  0 引言  40
  1 材料  40-41
    1.1 菌种  40
    1.2 培养基  40-41
    1.3 主要仪器  41
  2 方法  41-43
    2.1 形态鉴定  41
    2.2 生理生化特征鉴定  41
    2.3 分子鉴定  41-43
  3 结果与分析  43-48
    3.1 形态特征结果  43-44
    3.2 生理生化特征结果  44-45
    3.3 分子鉴定  45-48
    3.4 小结  48
  4 结果与讨论  48-49
第四章 枯草芽孢杆菌BS24防病机理研究  49-65
  0 引言  49
  1 材料  49-50
    1.1 菌种  49
    1.2 供试植物病原菌  49
    1.3 培养基  49-50
    1.4 主要仪器  50
  2 方法  50-55
    2.1 拮抗菌株无细胞培养滤液制备  50
    2.2 病原菌孢子悬液制备  50
    2.3 拮抗菌株对病原菌生长的影响  50-51
    2.4 拮抗菌株在离体叶片上的定殖能力  51
    2.5 无细胞培养滤液对病原菌生长的影响  51
    2.6 无细胞培养滤液对病原菌菌丝形态的影响  51
    2.7 培养滤液对病原菌孢子萌发的影响  51-52
    2.8 抑菌物质的分离纯化  52
    2.9 抑菌物质的分析  52-53
    2.10 抑菌谱测定  53
    2.11 稳定性分析  53-54
    2.12 菌株BS24产真菌细胞壁水解酶能力检测  54
    2.13 数据分析  54-55
  3 结果与分析  55-62
    3.1 拮抗菌株对病原菌生长的抑制  55
    3.2 拮抗菌株在离体叶片上的定殖能力  55
    3.3 无细胞培养滤液对病原菌生长的抑制作用  55-56
    3.4 无细胞培养滤液对病原菌菌丝形态的影响  56-57
    3.5 无细胞培养滤液对病原菌孢子萌发的抑制作用  57
    3.6 抑菌物质的分离纯化  57-58
    3.7 抑菌物质特性分析  58-59
    3.8 抑菌物质的抑菌谱  59
    3.9 抑菌物质稳定性分析  59-60
    3.10 菌株BS24产酶能力检测结果  60-62
  4 结论与讨论  62-65
第五章 枯草芽孢杆菌BS24发酵工艺优化  65-78
  0 引言  65
  1 材料  65-66
    1.1 菌种  65
    1.2 培养基  65
    1.3 主要仪器  65-66
  2 方法  66-68
    2.1 活菌数测定  66
    2.2 种子液制备  66
    2.3 初始发酵培养基的筛选  66
    2.4 发酵工艺优化设计  66-68
  3 结果与分析  68-75
    3.1 初始发酵培养基的确定  68-69
    3.2 影响发酵工艺的重要因子  69-71
    3.3 最陡爬坡试验结果  71
    3.4 中心组合设计试验结果  71-75
    3.5 模型验证  75
  4 结论与讨论  75-78
第六章 苹果早期落叶病田间防治试验  78-87
  0 引言  78
  1 材料  78-79
    1.1 供试菌株  78
    1.2 供试药剂  78
    1.3 试验地概况  78-79
  2 方法  79-80
    2.1 试验设计与实施  79
    2.2 调查方法  79
    2.3 病情分级标准  79-80
    2.4 果实感官评价  80
    2.5 果实农药残留检测  80
    2.6 果实重金属残留检测  80
    2.7 果树树势生长观察  80
    2.8 数据分析  80
  3 结果与分析  80-85
    3.1 防治效果  80-81
    3.2 果实感官评价结果  81-82
    3.3 果实农药残留检测结果  82
    3.4 果实重金属残留检测结果  82-83
    3.5 果树树势生长状况观察  83-85
    3.6 小结  85
  4 结论与讨论  85-87
第七章 总结  87-89
  1 主要结论  87-88
  2 下一步研究打算  88-89
参考文献  89-101
附录1 实验中所用培养基  101-104
附录2 测序结果  104-106
  1 菌株BS24的16S rDNA测序结果  104-105
  2 菌株D4的16S rDNA测序结果  105-106
攻读博士学位期间取得的研究成果  106-107
致谢  107

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 仁果类病虫害 > 苹果病虫害
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