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急性髓系白血病患者IDH1和IDH2基因突变的检测及临床意义

作　者: 米瑞华
导　师: 魏旭东
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: 白血病,髓系,急性 IDH1突变 IDH2突变预后
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的造血祖细胞的获得性遗传和表观遗传学的改变是急性髓系白血病(AML)的发病因索之一,这些变化改变了造血祖细胞生长、增殖和分化的正常机制。AML发病时骨髓原始细胞隐藏着一种或以上的染色体变异,这些变异不仅是AML的诊断标志,更是评价完全缓解率(CR)、复发风险(RR)及总生存(OS)的指标。然而,国外资料表明,AML的染色体核型异常检出率为60-80%。因此,仍有一大部分AML患者没有发现染色体变异,这组患者为核型正常的AML (CN-AML),是AML中占比例最多的亚型,按细胞遗传学分析,它们归为预后中等组。临床观察发现,CN-AML组患者中,同一亚型,相同的临床治疗方案,疾病的缓解状况、疗效和预后存在较大的差异,原因可能为患者潜在的分子生物学特征不同,即这些病人在分子学上是有异质性的,对患者分子预后指标的研究是近年分子学研究的热点,例如：目前研究的较为透彻的与发病直接相关的基因,如PML-RARα、AML1-ETO等；文献报道某些基因如亲病毒整合位点基因(EVI-1)、ETS相关基因(ERG)、脑和白血病胞质基因(BAALC)、脑膜瘤-1基因(MN1)、核转录因子(NF-κB)等的过表达提示患者预后显著不良。也有一些基因的突变与预后良好有关,如核磷蛋白基因(NPM1)、CCAAT增强结合因子α基因(C/EBPa)等；另外,一些基因的突变也与预后差有关,如FMS样酪氨酸激酶3基因(FLT3)、肾母细胞瘤1基因(WT1)、c-KIT、混合细胞系白血病部分串联重复基因(MLL-PTD)等。异柠檬酸脱氢酶(IDH)家族包括借助NAD或NADP作为辅助因子,催化异柠檬酸的氧化脱酸反应生成α-酮戊二酸的酶类,同时分别生成NADH或NADPH。在哺乳动物细胞中,IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH,依赖NADP的线粒体IDH,依赖NADP的胞质IDH。编码依赖NADP的人IDH1酶的IDH1基因位于染色体2q33.3,并且定位于细胞质和过氧化物酶体中[5];编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26.1。尽管IDH1和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制[7,8],但IDH1在脂质的代谢机制中起了重要作用。近年来,通过全基因组测序,发现IDH1和IDH2突变存在于AML、急性淋巴细胞白血病(ALL)及骨髓增殖性疾病(MPD)中,在慢性粒细胞白血病(CML)中尚未检测到突变。文献报道IDH1和IDH2突变在CN-AML患者中的发生率分别为5.5-9.6%[10-14]和3-11%[12-14],并认为具有IDH1和IDH2突变的AML患者具有较低的CR,较高的RR和较短得OS。目前国内未见此方面的研究报道。本课题采用RT-PCR结合基因组测序技术,评估IDH1和IDH2基因突变在96例患者中的发生频率和预后影响,并探讨这些基因的表达与细胞遗传学、分子危险度分层以及与AML中常见基因突变的关系。对象与方法1.2009年9月至2011年1月我院门诊及病房收治的96例初治AML患者,所有患者均经FAB及MIC确诊,染色体分析采用R显带技术,每例至少分析20个克隆。2.每例初发患者取骨髓血2ml,行白血病免疫分型分析。单克隆抗体包括髓系相关抗原：CD13, CD33, CD11b, CD117, CD64, cMPO, CD15, CD14和CD41a;淋系相关抗原包括：CD2, CD5,CD7,CD4, CD3,CD8,cCD3,CD19, CD10,CD22和CD20；非特异性抗原包括HLA-DR, CD34和CD56。3.每例患者抽取抗凝骨髓或外周血5ml,密度-梯度离心法分离单个核细胞,细胞悬液置-80℃保存。4.IDH基因突变检测：按总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA；逆转录反应体系20ul具体如下：dNTP Mixture(10mMeach)1ul,Random 6 mers(20uM),Template RNA 100pg～1ug, RNase Free dH2O up to lOul,65℃5min,4℃; 5×PrimeScriptTM Buffer 4ul, RNase inhibitor(40U/ul)0.5ul, PrimeScriptTM RTase(for 2 step)0.5ul, RNase Free dH2O 5ul,30℃10min,42℃15min,95℃5min,4℃;PCR反应25ul反应条件为：94℃5min; 94℃1min,60℃1min,72℃1min 30个循环；72℃7min；4℃。引物序列如下：IDH1基因第4外显子扩增引物,上游引物5’-CTTCAGAGAAGCCATTATCTG-3’,下游引物5’-TCACTTGGT GTGTAGGTTATC-3’,扩增产物159bp;IDH2基因第4-6外显子扩增引物,上游引物5’-GTTCAAGCTGAAGAAGATGTG-3’,下游引物5’-TGAGATGG ACTCGTCGGTG-3’,扩增产物313bp。5.同时,我们对FLT3-ITD、FLT3-TKD、c-KIT进行突变检测。按血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA；四种基因的PCR反应体系25u1,反应条件为：95℃5min；94℃30s,55℃1min,72℃1min 40个循环；72℃10min；4℃。FLT3-ITD基因14、15外显子扩增引物,上游引物5’-GCAATTTAGGT ATGAAAGCCAGC-3’,下游引物5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’,扩增产物329bp;FLT3-TKD基因第20外显子扩增引物,上游引物5’-CCGCCAGGAACGTGCTTG-3’,下游引物5’-GCAGACGGGCATTGCCCC-3’,扩增产物114bp;c-KIT基因第17外显子扩增引物,上游引物5’-ATGG AGGATGACTTG-3’,下游引物5’-ATCCCATAGGACCAGACG-3’,扩增产物302bp。6.PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,对阳性标本按DNA产物纯化回收试剂盒说明书进行纯化回收,直接测序进行基因突变检测。结果1.染色体结果：96例患者中,核型正常者67例；核型异常者24例,包括：t(8；21)6例,t(15；17)8例,-11者1例,-7者1例,+8者3例,+21者1例,t(7；11)者1例,复杂核型3例；检测失败者5例。2.IDH突变检测结果：96例患者中IDH1R132未发现突变,IDH1P127突变14例,IDH1I130突变14例；IDH2R172未发现突变,IDH2R140突变2例,IDH1突变的发生率为14.6%(14/96)；IDH2突变的发生率为2.17%(2/96)。3. FLT3-ITD、FLT3-TKD、c-KIT突变检测结果：96例患者中FLT3-ITD阳性12例,FLT3-TKD阳性5例,c-KIT突变2例；FLT3突变的发生率为17.7%(17/96)；c-kit在核心结合因子型白血病患者中的发生率为33.3%(2/6)。4.IDH与FLT3-ITD、FLT3-TKD、c-KIT突变的关系：IDH突变多发生在核型正常患者(p=0.021),因后2种基因突变检出率较低,尚未与IDH突变进行统计学分析。5.IDH突变与临床资料的关系：IDH突变的患者白细胞计数较高,血小板计数较低：IDH2突变者具有年龄偏大的特点。6.IDH突变与免疫表型的关系：IDH突变阳性的患者表达HLA-DR、CD33、CD34、CD13抗原。7.IDH突变与临床疗效的关系：IDH突变阳性患者,具有缓解率低,复发率高的特点。结论1. IDH突变是AML患者的分子突变类型之2. IDH突变可能是AML患者的不良预后因素。3. IDH突变可能为白血病的分层治疗提供依据。

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中文摘要  4-8
Abstract  8-14
中英文缩略词对照表  14-15
前言  15-17
材料与方法  17-28
结果  28-30
附图表  30-35
讨论  35-38
小结  38-39
参考文献  39-44
急性髓系白血病患者分子预后指标研究进展  44-57
  参考文献  53-57
硕士期间发表论文  57
硕士期间参与的课题  57-58
致谢  58

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