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缺血预处理、后处理以及远端肢体预处理对离体大鼠心肌保护作用研究

作　者: 段欣
导　师: 龙村；于坤；吉冰洋
学　校: 北京协和医学院
专　业: 麻醉学
关键词: 药物后处理 环孢素A 酸性液后处理 缺血再灌注损伤 心肌保护 缺血预处理 缺血后处理 远端缺血预处理 微小RNA
分类号: R542.22
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：缺血后处理已经证实具有心脏保护作用,并与线粒体膜通透性转换孔状态有关。同时还有研究发现在再灌注开始短暂的酸性缓冲液灌注也具有心肌保护作用,其机制可能与线粒体膜通道转换孔状态有关。本研究通过心肌停搏液停搏的离体大鼠心脏模型,评价线粒体膜通透性转换孔开放阻断剂环孢素A(cyclosporine A, CsA),酸性缓冲液或者含有环孢素的酸性缓冲液是否具有与经典缺血后处理相同的心肌保护作用。环孢素A后处理以及酸性缓冲液后处理心肌保护机制是否与抑制线粒体膜通透性转换孔开放有关。方法：取SD大鼠心脏,建立离体langendorff心肌缺血再灌注模型,随机分五组(每组12只)。对照组(Con组)：经历平衡期20分钟,灌注停跳液后室温模拟缺血30分钟,再灌注60分钟。缺血后处理组(Ipo组)：再灌注开始时给予10秒再灌注,10秒阻断,共六个循环。环孢素A后处理组(CsA组)：再灌注开始5分钟给予含有环孢素A (0.8μmol/L) Krebs-Henseleit缓冲液灌注。酸性缓冲液后处理组(Low pH组)：再灌注开始3分钟给予酸性Krebs-Henseleit缓冲液灌注(pH：6.8)。酸性缓冲液联合环孢素A后处理(Low pH+CsA组):再灌注开始3分钟给予含有0.2μmol/L环孢素A的酸性Krebs-Henseleit缓冲液灌注(pH：6.8)。检测各组平衡期,再灌注5、15、30、60分钟血流动力学指标；Western blot法检测胞浆细胞色素C含量；线粒体肿胀液检测线粒体膜通透性转换孔对Ca2敏感度；TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果：记录平衡期,再灌注5,15,30和60分钟,左室发展压,±dp/dtmax,心率,冠状动脉流量。五组在平衡期无差异。左室发展压：CsA组再灌注5,15,30分钟时,明显优于Con组；Low pH组再灌注15,30和60分钟时,明显优于Con组;Low pH+CsA组再灌注5,15分钟时,明显优于Con组；Ipo组再灌注期的LVDP较Con组未见明显差别。+dp/dtmax:CsA组再灌注5.15和30分钟时,明显优于Con组；Ipo组再灌注60分钟时,明显优于Con组；Low pH组再灌注30,60分钟时,明显优于Con组；Low pH+CsA组再灌注5,60分钟时,明显优于Con组。-dp/dtmax:CsA组再灌注5,15,30和60分钟时,明显优于Con组；Ipo组再灌注60分钟时,明显优于Con组；Low pH组再灌注15和30分钟时,明显优于Con组；Low pH+CsA组再灌注5,15,30和60分钟时,明显优于Con组。心率：Low pH+CsA组再灌注5分钟时,明显优于Con组,其余各组心率与Con无明显差别。再灌注期间各组冠脉流量较平衡期明显减少,各时间点组间比较,均无显著差异。Ipo组,CsA组,Low pH组和Low pH+CsA组的胞浆细胞色素C释放,较Con组明显减少。平衡期各组线粒体对Ca2+诱导的通透性转换孔开放敏感度无明显差别；再灌注5分钟线,Ipo组,CsA组,Low pH组和LowpH+CsA组线粒体对Ca2+诱导的通透性转换孔开放敏感度较Con明显降低。Ipo组,CsA组, Low pH组和Low pH+CsA组的心肌细胞凋亡率(1.38±0.41,1.10±0.22,1.50±0.50,1.60±0.89,每1000个细胞)明显低于Con组(3.60±0.89,每1000个细胞),(p<0.05)。结论：本研究显示经典缺血后处理,环孢素A后处理,酸性缓冲液后处理或联合环孢素A后处理能够减轻再灌注损伤引起的线粒体膜通透性转换孔开放增加所导致的细胞色素C释放,降低线粒体膜通透性转换孔对Ca2+敏感性,进而减少心肌细胞凋亡,环孢素A后处理,酸性缓冲液后处理或联合环孢素A后处理同时可以改善心脏血流动力学状况,可以达到与经典后处理相同的心肌保护作用,此外酸性缓冲液后处理与环孢素A后处理联合应用并不能增强心肌保护作用。目的：缺血预处理,远端预处理和后处理的心脏可以耐受更长时间的缺血再灌注所导致的损伤,被认为是一种有效的内源性心肌保护策略。并且已在临床应用证实具有减少心肌损伤,保护左室收缩功能的作用。microRNA是广泛存在真核生物中的一类,长度在20～23个核苷酸片段的非编码的小RNA分子,对基因表达进行负性调节。近年来,研究发现microRNA在一系列生物学现象中发挥作用,如发育,分化,代谢生长,增殖和凋亡等,有研究发现miRNA-1, miRNA-21和miRNA-24在缺血预处理晚期时相,表达增加。使用经历缺血预处理心脏提取的miRNAs注射至将要进行缺血再灌注处理的心脏中,结果发现心梗面积明显缩小,同时伴有eNOS和HSP70蛋白表达升高。miRNAs在缺血后处理和远端缺血预处理中的表达如何,是否与缺血预处理存在差异,目前尚无相关研究报道。在本实验中,我们在离体缺血再灌注心脏模型中观察预处理,后处理以及肢体远端预处理后心脏(?)niRNA-1和(?)niRNA-21表达变化,以及它们所调控靶基因Bcl-2, HSP70和PDCD4的蛋白表达变化,同时检测各组心肌梗死面积以及心肌细胞凋亡情况。方法：实验分为4组,每组12只SD大鼠。①对照组(CON组,n=12)：离体心脏经K-H缓冲液灌流平衡20min后,37℃全心缺血30min,K-H缓冲液再灌注60min(pH:7.4)②缺血预处理组(IPC组,n=12)：平衡期对全心进行2min缺血/2min再灌注共2个循环,37℃全心缺血30min,K-H缓冲液再灌注60min。③肢体远端缺血预处理组(RIPC组,n=12)：SD大鼠麻醉后,使用止血带对其双下肢进行5min缺血/5min再灌注共3个循环。同时使用改良经皮氧饱和度监测仪,明确操作是否成功。余处理步骤同CON组。④缺血后处理组(IPO组,n=12)心脏经K-H缓冲液灌流平衡20min后,37℃全心缺血30min,再灌注开始时对全心进行5s再灌注/5s缺血处理,共12个循环。采用real time RT-PCR方法检测各组miRNA-1和miRNA-21表达；western blot方法检测Bcl-2, HSP70和PDCD4, Bax蛋白表达变化；TTC法检测心肌梗死面积；TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果：四组在平衡期无差异。IPO组在再灌注期10min时,左室发展压和±dp/dtmax明显优于CON组。RIPC组在灌注期10min时,+dp/dtmax优于CON组。IPC在再灌注10min时,心率明显优于CON组；再灌注30min时,-dp、dtmax明显优于Con组。再灌注期间冠脉流量较平衡期明显减少,但[PC,IPO以及RIPC组较Con组无显著差别。IPC组心肌的miRNA-1(233±45%)和miRNA-21(356±33%)表达明显高于CON组。但是RIPC和IPO组心肌的miRNA-1表达较CON组,则明显降低[RIPC(61±16%),IPO(61±13%)]RIPC和IPO组的miRNA-21表达较CON组降低[RIPC(68±23%),IPO(68±11%)],但无统计学差异。CON组心肌的HSP70(121±12%)和PDCD4(130±11%)蛋白含量较其他各组均明显增加[HSP70:IPC (74±5%),RIPC(81±6%),IPO(67±11%).PDCD4:IPC(74±11%),RIPC(81±16%), IPO(83±12%)].CON组心肌的Bcl-2蛋白含量(54±12%)较其他实验组降低[IPC(73±8%),RIPC(79±16%),IPO(87±18%)],但无统计学差异。而Bax蛋白含量(63±8%)则明显高于其他各组[IPC(27±6%),RIPC(21±3%),IPO(27±4%)].CON, IPC,RIPC和IPO组凋亡率分别为：32.8±3.96% vs 15.2±4.21% vs 17.2±1.92% vs 15.6±4.04%.CON组凋亡细胞数较其他各组明显增加。IPC,RIPC以及IPO组左室心梗面积／左室总面积,明显低于CON组。各组心梗面积比例分别为：CON(51.77±4.3%)；IPC(31.7±4.1%)；RIPC(29.6±6.19%)；IPO(32.8±4.71%).结论：MiRNA-1和miRNA-21在缺血预处理,后处理以及远端预处理后,表达变化是不同的。缺血预处理,后处理以及远端预处理,可能调节心肌不同miRNAs表达变化；同时我们还发现在各处理组中,miRNA与其靶蛋白并不都是负性调节,可能由于靶基因受多个miRNAs调控。

全文目录


缩略语表  4-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-7
第一部分 药物后处理和或酸性缓冲液后处理对离体大鼠心肌保护作用研究  7-41
  中文摘要  7-9
  英文摘要  9-11
  前言  11-14
  材料和方法  14-24
  结果  24-29
  讨论  29-36
  参考文献  36-41
第二部分 MICRORNA-1和MICRORNA-21以及其靶蛋白在缺血预处理,后处理和远端预处理中表达变化  41-72
  中文摘要  41-43
  英文摘要  43-45
  前言  45-46
  材料与方法  46-54
  结果  54-60
  讨论  60-68
  参考文献  68-72
综述 缺血预处理,后处理及远距预处理和后处理对心肌保护的机制  72-97
  参考文献  84-97
个人简历  97-98
致谢  98-99

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 心肌疾病 > 心肌梗塞
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