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生防菌盾壳霉防治油菜菌核病的生态学基础及其应用研究

作　者: 杨龙
导　师: 李国庆
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉 核盘菌 油菜菌核病 农利灵 分子检测 存活 扩散 复合肥 木霉 黄色蠕形霉 生物防治
分类号: S476
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


生防菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的一种重寄生真菌,也是一种具有广阔应用前景的生防菌。应用盾壳霉防治油菜菌核病的策略包括花期施用(抑制核盘菌子囊孢子的侵染)和土壤施用(抑制核盘菌的菌核存活,减少初侵染源数量)。为了充分挖掘盾壳霉的防病潜力,本论文研究了盾壳霉在油菜花瓣和土壤中存活及扩散、以及影响盾壳霉存活或发挥活性的生态因子,包括温度、含水量、复合肥和其它重寄生真菌等。研究目的在于:从生态的角度评估利用盾壳霉防治油菜菌核病的潜力,为提高盾壳霉防治油菜菌核病的效果提供思路,为建立轻便化使用盾壳霉防治油菜菌核病技术体系提供理论依据。首先,利用盾壳霉突变菌株SV-5-2对杀菌剂农利灵(vinclozolin)、青霉素和链霉素的抗性,建立了利用选择性培养基定量检测盾壳霉的方法。结果表明:在常规马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中同时添加农利灵(vinclozolin,500μg a.i./ml)、青霉素(500μg a.i./ml)和链霉素(500μg a.i./ml)对盾壳霉SV-5-2分生孢子萌发和菌丝生长没有太大影响。基于这一结果,建立了监测盾壳霉存活动态的选择性分离技术。此外,基于PCR技术,还探讨了盾壳霉的分子检测技术。结果获得了特异性检测盾壳霉的两对PCR引物。结果还表明:分子检测技术可用于研究盾壳霉与核盘菌之间的菌丝互作、盾壳霉寄生核盘菌菌核以及盾壳霉在灭菌土的存活。研究了在中国华中地区田间条件下,盾壳霉分生孢子在油菜花瓣上的存活动态。2004和2005年的5次田间(A-E)试验结果表明:盾壳霉分生孢子可以在油菜花瓣上存活3～5 d。在5次试验中,盾壳霉分生孢子在油菜花瓣上的存活率分别为17.3%,14.3%,35.0%,62.6%和1.9%。研究结果还表明:盾壳霉分生孢子在油菜花瓣上的存活受天气的影响。在晴天的2次试验(C和D)中,盾壳霉分生孢子在油菜花瓣上的存活率较高。这表明:盾壳霉分生孢子可以忍耐阳光照射3～5 d。另外,在有降雨天气的3次试验(A,B和E)中,盾壳霉分生孢子在油菜花瓣上的存活率较低。盾壳霉数量减少的原因可能是雨水的冲刷作用。两年的花期喷雾试验结果表明:盾壳霉单独使用,以及将盾壳霉与杀菌剂菌核净混用,对油菜菌核病具有显著防效。就单独使用盾壳霉而言,推荐使用浓度为1×10~6个孢子/ml。研究了盾壳霉在旱地土壤中的存活动态。试验结果表明:在夏季～秋季～冬季～春季试验中,盾壳霉分生孢子存活10个月以上;在秋季～冬季～春季～夏季试验中,盾壳霉可存活25个月以上。在这两个试验中,盾壳霉数量呈下降趋势。在第一次试验中,盾壳霉数量从5.1×10~5个/g土下降到8.0×10~4个/g土。盾壳霉数量的对数值(Y)与时间(X)之间的关系是:Y=5.6416-0.0095X-0.00003X~2(r=-0.8006,P＜0.01);在第二次试验中,盾壳霉数量从7.2×10~5个/g土下降到3.9×10~4个/g土。盾壳霉数量的对数值(Y)与时间(X)之间的关系是:Y=6.3161-0.0023X(r=-0.8379,P＜0.01)。在夏季～秋季淹水条件下和冬季～春季的淹水条件下,盾壳霉可存活5个月以上。盾壳霉数量的对数值随时间呈直线下降,特别是在夏季～秋季淹水条件下。此外,还研究了温度和土壤含水量对盾壳霉在土壤中存活的影响。在4℃～28℃下,盾壳霉在3种含水量(6.3%、18.5%和45.4%,w/w)的土壤中可360 d以上。在30℃～40℃下,盾壳霉在土壤中的存活与土壤含水量有关。在低含水量(6.3%)土壤中,在30℃和35℃下,盾壳霉可以存活210 d;在37℃和40℃下,盾壳霉可存活180 d;在中含水量(18.5%)土壤中,在这4个温度下,盾壳霉存活时间分别下降至120 d,21 d,14 d和3 d;在高含水量(45.4%)土壤中,在这4个温度下的盾壳霉存活时间分别下降至120 d,14 d,3 d和3 d。在45℃和50℃下,盾壳霉在3种含水量的土壤中存活均很差,存活时间少于2 d。盆栽试验结果表明:土壤中接种不同剂量的盾壳霉分生孢子对降低核盘菌菌核萌发产生子囊盘有显著(P＜0.05)影响。随着盾壳霉接种剂量的增加,核盘菌子囊盘数量呈下降趋势。显著抑制核盘菌菌核萌发产生子囊盘的最低孢子浓度为10～1000个孢子/g土。两季大田试验结果表明:施用浓度1×10~5个/ml到1×10~7个/ml的盾壳霉均能显著抑制核盘菌菌核萌发产生子囊盘,对油菜菌核病亦有防治效果。研究了盾壳霉在4种不同土壤(黄棕壤、红壤、潮土、黑土)和砂子中的垂直扩散和水平扩散规律。结果表明:盾壳霉分生孢子可以随水分垂直扩散20 cm深,水平扩散10 cm远。两季盆栽试验结果表明:菌核埋入深度显著影响核盘菌菌核萌发产生的子囊盘数量,菌核埋入土壤深度5 cm以上时,基本不产生子囊盘。盾壳霉对菌核萌发产生子囊盘有显著的抑制作用。研究了盾壳霉与复合肥的相容性。结果表明:盾壳霉与复合肥有一定的相容性。一定浓度的复合肥对盾壳霉菌丝生长和分生孢子萌发有抑制作用,抑制强度与复合肥浓度呈正相关。但复合肥对盾壳霉没有致死作用,对其寄生菌核也没有显著影响。三季盆栽试验和两季大田试验结果均表明:盾壳霉与复合肥混用能显著降低核盘菌菌核萌发产生子囊盘,对油菜菌核病亦有防治效果。研究了盾壳霉、木霉和黄色蠕形霉单独使用,以及盾壳霉与木霉或黄色蠕形霉混用对核盘菌菌核萌发产生子囊盘的影响。盆栽试验结果表明:盾壳霉、木霉和黄色蠕形霉单独使用,以及盾壳霉与木霉或黄色蠕形霉混合使用,对核盘菌菌核萌发产生子囊盘均具有抑制效果,尤其是盾壳霉与木霉或黄色是蠕形霉混用的抑制效果更佳。结果还表明:秋季(10月份)使用这些生防菌抑制核盘菌子囊盘萌发的抑制效果比夏季(5月份)好。基于上述研究结果,建立了应用盾壳霉防治油菜菌核病的轻便化使用技术。这些技术包括:花期喷雾技术、水辅助扩散盾壳霉技术、盾壳霉～复合肥混用技术和盾壳霉与其它重寄生真菌(木霉或黄色蠕形霉)混合使用技术等。

全文目录


摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
第一章 文献综述  15-40
  1 核盘菌的研究进展  15-25
    1.1 核盘菌的分布及其危害  15
    1.2 核盘菌的生物学和生态学特性  15-17
    1.3 核盘菌的侵染过程  17-20
    1.4 核盘菌的致病机制  20-22
    1.5 油菜菌核病的症状和发病规律  22-23
    1.6 核盘菌菌核病的防治  23-25
  2 生防菌盾壳霉的研究进展  25-34
    2.1 盾壳霉的自然分布和生物学特性  25-26
    2.2 盾壳霉的生态学特性  26-29
    2.3 盾壳霉的生防机制  29-31
      2.3.1 重寄生作用  29-30
      2.3.2 抗生作用  30
      2.3.3 溶菌作用  30-31
    2.4 盾壳霉与核盘菌互作的分子机制  31
    2.5 盾壳霉的分子生物学研究  31-32
    2.6 盾壳霉的遗传改良  32
    2.7 盾壳霉的规模化生产及制剂的研制  32-33
    2.8 盾壳霉在核盘菌菌核病防治中的应用  33-34
    2.9 利用盾壳霉的前景展望  34
  3 生防真菌检测技术的研究进展  34-39
    3.1 选择性(半选择性)培养基的使用  35
    3.2 酶联免疫分析  35
    3.3 单克隆抗体技术  35-36
    3.4 分子检测  36-39
      3.4.1 分子标记技术  36-37
      3.4.2 基因标记技术  37-39
  4 本研究的意义和主要研究内容  39-40
    4.1 课题的意义  39
    4.2 课题的研究内容  39-40
第二章 盾壳霉检测技术的建立  40-57
  1 材料与方法  40-48
    1.1 供试真菌菌株、培养基和药剂  40-41
    1.2 选择性培养基的筛选  41-42
    1.3 盾壳霉的分子检测  42-48
      1.3.1 五种真菌的总DNA的提取及电泳检测  42
      1.3.2 核糖体RNA基因转录间隔区序列(ITS)的PCR扩增  42-43
      1.3.3 PCR产物的纯化、回收及序列测定  43-45
      1.3.4 盾壳霉分子检测引物的合成  45
      1.3.5 常规PCR和巢式PCR扩增  45
      1.3.6 盾壳霉PCR检测的特异性检验  45-46
      1.3.7 常规PCR和巢式PCR检测的灵敏度比较  46
      1.3.8 常规PCR和巢式PCR检测体系的实际应用验证  46-48
        1.3.8.1 盾壳霉在与核盘菌互作过程中的分子检测  46-47
        1.3.8.2 盾壳霉寄生菌核中的分子检测  47
        1.3.8.3 盾壳霉在土壤中的分子检测  47-48
    1.4 数据统计分析  48
  2 结果与分析  48-55
    2.1 应用选择性培养基检测盾壳霉  48-51
      2.1.1 青霉素、链霉素和农利灵对抗性菌株SV-5-2孢子萌发的影响  48
      2.1.2 青霉素、链霉素和农利灵对抗性菌株SV-5-2菌丝生长的影响  48-51
    2.2 应用PCR技术检测盾壳霉  51-55
      2.2.1 盾壳霉PCR检测的特异性  51-52
      2.2.2 常规PCR和巢式PCR检测盾壳霉的灵敏度  52-53
      2.2.3 PCR检测在研究盾壳霉～核盘菌互作中的应用  53-54
      2.2.4 PCR检测在研究盾壳霉寄生核盘菌菌核中的应用  54
      2.2.5 盾壳霉在土壤中的分子检测  54-55
  3 讨论  55-57
第三章 盾壳霉在油菜花瓣上的存活及防病效果  57-66
  1 材料与方法  58-60
    1.1 供试真菌菌株、培养基和药剂  58
    1.2 盾壳霉在油菜花瓣上的存活动态  58-59
    1.3 盾壳霉花期喷雾对油菜菌核病的抑制  59-60
      1.3.1 花期喷雾使用盾壳霉防治油菜菌核病的大田试验  59-60
      1.3.2 浓度对盾壳霉防治油菜菌核病的影响  60
    1.4 数据统计分析  60
  2 结果与分析  60-65
    2.1 盾壳霉在油菜花瓣上的存活动态  60-62
    2.2 花期喷雾使用盾壳霉对油菜菌核病的防治  62-64
    2.3 盾壳霉孢子浓度对其防治油菜菌核病的影响  64-65
  3 讨论  65-66
第四章 盾壳霉在土壤中的存活及其对菌核萌发的抑制  66-81
  1 材料与方法  67-70
    1.1 供试真菌菌株、培养基和土壤  67
    1.2 盾壳霉在旱地中的存活动态  67-68
    1.3 盾壳霉在淹水条件下的存活动态  68
    1.4 温度和土壤含水量对盾壳霉在土壤中存活的影响  68-69
    1.5 盾壳霉孢子浓度对其抑制核盘菌菌核萌发的影响  69-70
      1.5.1 盆钵试验:盾壳霉孢子浓度对其抑制核盘菌菌核萌发的影响  69
      1.5.2 大田试验:盾壳霉孢子浓度对其抑制核盘菌菌核萌发的影响  69-70
    1.6 气象资料分析  70
    1.7 数据统计分析  70
  2 结果与分析  70-78
    2.1 盾壳霉在旱地土壤中的存活动态  70-73
    2.2 盾壳霉在盐水条件下的存活动态  73-74
    2.3 温度和土壤含水量对盾壳霉在土壤中存活的影响  74-76
    2.4 盆钵试验:盾壳霉孢子浓度对其抑制核盘菌菌核萌发的影响  76-77
    2.5 大田试验:盾壳霉孢子浓度对其抑制核盘菌菌核萌发的影响  77-78
  3 讨论  78-81
第五章 水辅助盾壳霉分生孢子在土壤中的扩散  81-92
  1 材料与方法  82-84
    1.1 供试真菌菌株、培养基和药剂  82
    1.2 供试土壤及其特性测定  82
    1.3 盾壳霉在土壤中的垂直扩散  82-83
    1.4 盾壳霉在土壤中的水平扩散  83
    1.5 菌核埋入土壤深度对萌发形成子囊盘的影响  83-84
    1.6 数据统计分析  84
  2 结果与分析  84-89
    2.1 盾壳霉在土壤中的垂直扩散  84-86
    2.2 盾壳霉在土壤中的水平扩散  86-89
    2.3 菌核埋入土壤深度对其萌发形成子囊盘的影响  89
  3 讨论  89-92
第六章 复合肥与盾壳霉混用防治油菜菌核病的研究  92-102
  1 材料与方法  92-95
    1.1 供试真菌菌株、培养基、肥料和土壤  92
    1.2 复合肥对盾壳霉菌丝生长的影响  92-93
    1.3 复合肥对盾壳霉分生孢子萌发的影响  93
    1.4 复合肥对盾壳霉寄生核盘菌菌核的影响  93
    1.5 复合肥对核盘菌菌丝生长的影响  93
    1.6 复合肥对核盘菌菌核萌发的影响  93
    1.7 盆栽试验:复合肥和盾壳霉混用对核盘菌菌核萌发的抑制  93-94
    1.8 大田试验:复合肥和盾壳霉混用对核盘菌菌核萌发的抑制  94-95
    1.9 数据统计分析  95
  2 结果与分析  95-101
    2.1 复合肥对盾壳霉菌丝生长的影响  95
    2.2 复合肥对盾壳霉分生孢子萌发的影响  95-96
    2.3 复合肥对盾壳霉寄生菌核的影响  96-97
    2.4 复合肥对核盘菌菌丝生长的影响  97-98
    2.5 复合肥对核盘菌菌核萌发的影响  98
    2.6 盆栽试验:复合肥和盾壳霉混用对核盘菌菌核萌发的抑制  98-99
    2.7 大田试验:复合肥和盾壳霉混用对核盘菌菌核萌发的抑制  99-101
  3 讨论  101-102
第七章 盾壳霉和其它重寄生真菌混用对核盘菌菌核萌发的抑制  102-106
  1 材料与方法  102-104
    1.1 供试真菌菌株、培养基和土壤  102-103
    1.2 盾壳霉和木霉、黄色蠕形霉混用对核盘菌菌核萌发的抑制  103
    1.3 数据统计分析  103-104
  2 结果与分析  104-105
  3 讨论  105-106
第八章 全文总结、意义与展望  106-109
  一、总结  106-107
  二、意义  107-108
  三、展望  108
  四、本研究的创新点  108-109
参考文献  109-134
附录 博士在读期间已发表的文章  134-135
致谢  135

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