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Gli2FL/Gli2Rep的变化对小鼠Hedgehog信号通路活性和生长发育的影响

作　者: 李娟
导　师: 白增亮；Baolin Wang
学　校: 山东大学
专　业: 发育生物学
关键词: Gli2 Gli3 Hedgehog信号活性 Gli2、Gli3蛋白水解
分类号: S865.13
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景和目的Hedgehog(Hh)家族分泌信号分子在从果蝇到人类的多项胚胎结构的发育图式中起到重要的作用。Hh信号分子与Patched(Ptc)受体结合后抑制其功能,释放受其抑制的跨膜蛋白Smoothened(Smo),进而激活细胞内一系列信号级联反应。在鼠中,Hh信号通路受到三类Gli转录因子的调节,Glil,Gli2和Gli3。三类蛋白即存在功能上的重叠,也具有各自独特的功用,这很大程度上决定于三者固有的不同的蛋白分子本质。在Hh信号缺失时,大部分全长Gli3蛋白Gli3FL水解成Gli3转录抑制子Gli3Rep。Gli3的水解取决于其C末端的多个丝氨酸苏氨酸磷酸化位点,受到PKA的激活之后,CKl和GSK3也使其磷酸化。磷酸化的Gli3FL与SCFβTrCP泛素E3连接酶结合并被泛素化,接着被蛋白小体在特异位点降解成Gli3抑制子。Hh信号分子抑制Gli3水解并激活Gli3FL,从而导致Gli目的基因的上调表达。Gli2是调节Hh信号通路的主要的转录激活子。同Gli3FL,小鼠Gli2FL同样水解产生抑制子,但水解程度却远低于Gli3。该水解的不同取决于二者不同的水解决定结构域(PDD),该结构域由位于锌指DNA结合域和第一个PKA磷酸化位点之间的197个氨基酸组成。Gli3 null背景下的Gli2突变鼠中有关体节发育的研究揭示了Gli2具有弱抑制子活性,与我们之前的发现Gli2抑制子水平极低一致。因此,对Gli2在Hh信号通路中Gli2是否具有抑制功能一直存在争议,需要进一步的深入研究。我们前期研究将Gli3PDD替换Gli2对应位置,体外培养细胞中Gli2的水解程度增加,生成更多Gli2抑制子。为了研究体内的情况,对Gli2抑制子的功能意义有更深的了解,在该研究中我们构建了Gli23PDD突变小鼠,并对其表型做了一系列分析。鼠中Hh信号通路中Gli蛋白的角色在斑马鱼中几乎保守,但也有不同。例如,斑马鱼Glil也是一个强有力的转录激活子,但不同于鼠的Gli1,其对斑马鱼的胚胎发生是非常重要的。除此之外,遗传分析表明,斑马鱼Gli2和Gli3在Hh信号通路中的角色于鼠中Gli2和Gli3类似。在该研究中我们对斑马鱼Gli2和Gli3是否存在不同的水解进行了阐释。研究方-法1、ES细胞培养；转基因小鼠制备；磷酸钙转染；免疫印记分析2、胎鼠剥离；神经管冰冻切片；免疫组化3、原位杂交；小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的分离；RT-PCR4、脂质体转染；荧光酶报告子活性分析；免疫印记分析研究结果1、Gli2和Gli3的不同水解程度在小鼠和斑马鱼中是保守的2、Gli2FL激活子和抑制子的比例的变化对小鼠神经管发育图式无影响,但引起体重的微小改变3、Gli2FL激活子和抑制子的比例的变化降低了小鼠神经管和肢翼发育中的Hh信号通路活性4、Gli23PDD转录活性低于Gli2,其水解受到Hh信号分子的调控研究结论在这项研究中,我们首次证明了Gli2和Gli3不同程度的水解在小鼠和斑马鱼中具有进化保守性。之前的研究证明二者的水解程度不同是由于PDD结构域氨基酸序列的不同所致,Gli2-3PDD嵌合蛋白的水解程度明显增加,构建的Gli23PDD突变小鼠总体来说是正常并可育的,但相比早期同龄的同窝野生型小鼠,突变鼠的平均体重要轻。胚胎神经管发育图式的分析未显示出突变鼠与野生鼠的差别。不同于神经管表型分析结果,Gli23PDD突变鼠的脊索和肢芽中Glil和Ptchl的表达水平却有明显降低。全长Gli23PDD转录活性比野生型Gli2转录活性降低,且该突变蛋白可以充分的对Hh信号产生应答。这些结果表明Gli2FL/Gli2Rep保持一个合适的平衡对Hh信号通路功能的行使是很重要的。由于Gli2和Gli3的水解是Hh信号通路中调控Gli2和Gli3活性的关键步骤,我们的发现在某种程度上解释了为何Gli2和Gli3的功能在小鼠和斑马鱼中是保守的。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
符号说明  13-14
第一部分研究背景  14-44
  (一) Hh信号通路的调控机制和重要性  14-30
    1. Hh信号通路  14-17
    2. Hh在脊椎动物神经管发育形成中的信号转导机制  17-23
    3. Hh在脊椎动物肢翼图式形成中的调节机制  23-25
    4. Hh在体节发育图式中的调控作用  25-28
    5. 纤毛在Hh信号转导通路中的关键作用  28-30
  (二) GLI蛋白家族的功能及Gli2,Gli3的水解调控  30-44
    1. GLI蛋白家族的功能  30-35
    2. GLI蛋白的活性调节  35-37
    3. GLI基因的种属特异性  37-39
    4. Gli2和Gli3的蛋白水解  39-41
    5. 值得研究的几个问题  41-44
第二部分 Gli2~(3PDD)突变小鼠的制备  44-64
  前言  44
  实验材料与仪器设备  44-52
  实验方法  52-57
  实验结果  57-61
  讨论  61-64
第三部分 Gli2~(3PDD)突变小鼠表型分析  64-88
  前言  64-65
  实验材料与仪器设备  65-70
  实验方法  70-77
  实验结果  77-84
  讨论  84-88
创新性分析及展望  88-89
参考文献  89-103
攻读博士学位期间发表的学术论文  103-104
致谢  104-105
英文论文  105-129
学位论文评阅及答辩情况  129

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