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PGE2调节前列腺中芳香化酶和钙结合蛋白S100A8分子机制的研究

作　者: 苗琳
导　师: 张琚
学　校: 南开大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 前列腺素 E2(PGE2) 芳香化酶 钙结合蛋白 S100A8 良性前列腺增生(BPH) 前列腺癌(PCa)
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)是一种重要的炎性因子。它通过调节细胞增殖、迁移和凋亡等生物学行为在许多疾病中发挥重要作用。在良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)和前列腺癌(prostate cancer, PCa)组织中PGE2的浓度明显增加,但对其作用分子机制的研究鲜有报道。BPH间质细胞中芳香化酶和PCa上皮细胞中钙结合蛋白S100A8的表达明显增加。本文研究PGE2调节芳香化酶和S100A8的信号通路,为阐明PGE2在BPH和PCa中可能的作用机制提供理论和实验依据。第一部分PGE2在ERRα的介导下促进前列腺间质细胞中芳香化酶的表达方法用RT-PCR法检测人前列腺间质细胞系WPMY-1中PGE2受体EPs的表达；在WPMY-1中,分别添加PGE2和／或PGE2受体EP2拮抗剂AH6809和激动剂butaprost、蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)抑制剂H89、MEK激酶抑制剂PD98059和cAMP激活剂forskolin,用Real-time RT-PCR和Western blot法检测雌激素受体相关受体(Estrogen receptor-related receptorα, ERRa)的基因和蛋白水平的表达；用cAMP试剂盒检测PGE2对间质细胞中cAMP浓度的影响；添加PGE2和/或ERRα拮抗剂氯丹、转染ERRα的siRNA或表达质粒,用Real-time RT-PCR、Western blot和双荧光素酶活性实验方法检测ERRα在PGE2调节WPMY-1细胞中芳香化酶的表达及其影响启动子活性中的介导作用；用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunopreciptation Assay, ChIP)方法检测PGE2对ERRα结合芳香化酶启动子的影响；用酶联免疫方法检测添加PGE2联合转染ERRαsiRNA或表达质粒的间质细胞培养液中雌二醇的浓度。结果WPMY-1细胞表达除EP1外的其余三种EP受体；PGE2或EP2的激动齐butaprost或cAMP激活剂forskolin能够促进ERRαmRNA和蛋白的表达；EP2的拮抗剂AH6809和PKA抑制剂H89能够完全拮抗PGE2对ERRα表达的上调作用,而MEK激酶抑制剂PD98059则无明显作用；PGE2能够以时间依赖方式促进cAMP的生成；用ERRα拮抗剂氯丹或siRNA以及用ERRα的表达质粒能够明显阻断或促进PGE2对芳香化酶基因表达和启动子活性的上调作用；在细胞内ERRα通过直接特异性结合芳香化酶启动子pI.3/Ⅱ激活转录,而且PGE2可以加强这种促进转录作用；PGE2联合转染ERRαsiRNA或表达质粒的间质细胞培养液中雌二醇的浓度与PGE2和ERRα的水平呈正相关。结论在前列腺间质细胞中,PGE2在EP2介导下通过PKA信号通路促进ERRα的表达；ERRα作为转录因子介导了PGE2对芳香化酶表达的促进作用,进而导致间质细胞中雌二醇浓度的增加。提示,PGE2可能在促进前列腺中雌激素的生成以及由于雌激素效应的增加诱导前列腺间质增生中发挥重要的作用。第二部分PGE2在C/EBPβ的介导下促进前列腺癌上皮细胞中S100A8的表达方法在人前列腺癌上皮细胞系PC-3中,添加PGE2和／或PGE2受体EP2拮抗剂AH6809、EP4拮抗剂AH23848、PKA抑制剂H89和cAMP激活剂forskolin,用Real-time RT-PCR和双荧光素酶活性实验方法检测S100A8的表达和启动子活性；用cAMP试剂盒检测PGE2对PC-3细胞中cAMP浓度的影响。用Real-time RT-PCR和Western blot法检测PGE2对C/EBPβ的基因和蛋白表达的影响；用Western blot法检测PGE2对C/EBPβ磷酸化的影响；添加PGE2和／或转染增强子结合蛋白β(CCAAT/Enhancer binding proteinβ, C/EBPβ)的siRNA或表达质粒,用Real-time RT-PCR和双荧光素酶活性实验方法检测C/EBPβ在PGE2调节PC-3细胞中S100A8表达及其影响启动子活性中的介导作用。用免疫组化染色法检测前列腺癌组织的连续切片中环氧合酶2 (Cyclooxygenase-2, COX-2)和S100A8的表达及定位情况。结果PGE2能够以时间和浓度依赖的方式促进PC-3细胞中S100A8基因的表达和cAMP的生成；EP2的拮抗剂AH6809、EP4的拮抗剂AH23848和PKA抑制剂H89能够拮抗PGE2对S100A8表达和启动子活性的上调作用；cAMP激活剂forskolin亦可以促进S100A8的表达和启动子的活性。PGE2能够以时间依赖的方式促进C/EBPβ基因和蛋白的表达及其磷酸化水平；C/EBPβ的siRNA能够明显阻断PGE2对S100A8基因表达和启动子活性的上调作用；C/EBPβ的表达质粒能够明显促进S100A8的表达和启动子的活性。在同一前列腺组织切片中,COX-2和S100A8在正常腺体部分的上皮细胞呈阴性染色,而癌腺体上皮细胞呈明显阳性染色。结论在前列腺癌上皮细胞中,PGE2在EP2和EP4受体的介导下通过PKA信号通路促进S100A8的表达；PGE2亦能够促进C/EBPβ的表达和转录活性；C/EBPβ作为转录因子介导了PGE2对S100A8表达的促进作用。提示,PGE2可能通过上调钙结合蛋白S100A8在前列腺癌中发挥重要的作用。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-14
常用英文缩写索引  14-16
第一部分 PGE2在ERRα的介导下促进前列腺间质细胞中芳香化酶的表达  16-83
  第一章 前言  16-30
    1.1 PGE2在良性前列腺增生中的作用  16-19
    1.2 芳香化酶的生物学特征及其与良性前列腺增生的关系  19-24
    1.3 雌激素受体相关受体α的研究现状  24-29
    1.4 选题意义  29-30
  第二章 材料和方法  30-54
    2.1 良性前列腺增生组织标本来源  30
    2.2 主要仪器、试剂和溶液的配制  30-39
    2.3 细胞培养  39-41
    2.4 细胞总RNA提取及浓度测定  41-42
    2.5 逆转录合成cDNA  42-43
    2.6 普通RT-PCR及实时定量RT-PCR  43-44
    2.7 Western Blot  44-48
    2.8 芳香化酶启动子荧光素酶报告质粒的构建和ERRα表达质粒  48-49
    2.9 ERRα的siRNA的合成  49
    2.10 基于脂质体的真核细胞瞬时转染  49-50
    2.11 荧光素酶活性的检测  50
    2.12 腺苷酸环化酶浓度的检测  50
    2.13 培养液中雌激素浓度的检测  50-51
    2.14 染色质免疫共沉淀  51-53
    2.15 数据处理和统计学分析  53-54
  第三章 结果  54-67
    3.1 PGE2促进WPMY-1细胞中ERRα的表达  54-57
    3.2 ERRα的拮抗剂抑制PGE2对芳香化酶表达和启动子活性的上调作用  57-60
    3.3 ERRα特异的siRNA阻断PGE2对芳香化酶表达和启动子活性的上调作用  60-62
    3.4 过表达ERRα促进PGE2对芳香化酶基因表达和启动子活性的上调作用  62-64
    3.5 PGE2促进ERRα与芳香化酶启动子的相互作用  64-65
    3.6 PGE2在ERRα介导下促进WPMY-1细胞中雌二醇的生成  65-67
  第四章 讨论  67-72
  第五章 结论  72-73
  参考文献  73-83
第二部分 PGE2在C/EBPβ的介导下促进前列腺癌上皮细胞中S100A8的表达  83-125
  第一章 前言  83-93
    1.1 PGE2在前列腺癌中的作用  83-87
    1.2 S100A8基因表达的调节及与前列腺癌的关系  87-89
    1.3 C/EBPβ的生物学特点及其在前列腺疾病中的作用  89-92
    1.4 选题意义  92-93
  第二章 材料和方法  93-99
    2.1 前列腺癌标本来源  93
    2.2 主要仪器、试剂和溶液的配制  93-94
    2.3 前列腺癌上皮细胞系PC-3的培养和实验前处理  94
    2.4 普通RT-PCR和实时定量RT-PCR  94-95
    2.5 Western Blot  95
    2.6 S100A8基因启动子的荧光素酶报告质粒的构建和C/EBPβ表达质粒  95-96
    2.7 C/EBPβ siRNA的合成  96-97
    2.8 基于脂质体的真核细胞瞬时转染  97
    2.9 荧光素酶活性的检测  97
    2.10 腺苷素环化酶浓度的检测  97
    2.11 IHC染色分析  97-98
    2.13 数据处理和统计学分析  98-99
  第三章 结果  99-112
    3.1 PGE2促进前列腺癌细胞系PC-3中S100A8的表达  99-104
    3.2 PGE2促进前列腺癌细胞系PC-3中cAMP的生成  104-105
    3.3 PGE2促进前列腺癌细胞系PC-3中C/EBPβ的表达  105-106
    3.4 PGE2促进前列腺癌细胞系PC-3中C/EBPβ的转录活性  106
    3.5 过表达C/EBPβ促进S100A8的表达和启动子活性  106-108
    3.6 C/EBPβ的siRNA阻断PGE2对S100A8表达和启动子活性的上调作用  108-110
    3.7 COX-2和S100A8在前列腺癌腺上皮细胞中高表达  110-112
  第四章 讨论  112-116
  第五章 结论  116-117
  参考文献  117-125
致谢  125-127
个人简历  127

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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