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转il-4基因大白菜（Brassica pekinensis）及其杂交后代的分子检测及il-4遗传、表达研究

作　者: 张作青
导　师: 于丽杰
学　校: 哈尔滨师范大学
专　业: 植物学
关键词: 大白菜白细胞介素4 分子检测遗传表达
分类号: S634.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究以花粉管通道法转化得到的il-4基因大白菜（Brassica pekinensis）哈白二号、潍白六号和新世纪三个品种为试验材料,通过PPT、Kna抗性筛选、PCR扩增、PCR-Southern杂交、ELISA和Western杂交等技术,对转il-4基因大白菜后代进行分子生物学检测,同时对il-4基因在T₅、T₆、T₇代自交大白菜中的传递规律和表达情况进行了探讨。并对已经检测的自交后代阳性株不同株系间进行杂交,试图提高后代阳性率和蛋白表达量。另外,对阳性后代植株表型、抗病性进行了调查。本研究中,共播转il-4基因T₅代种子608粒,实际出苗421株,得到280株PPT抗性株,植株的PPT的抗性分离情况都符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德尔分离规律。PCR检测il-4阳性株26株,阳性率为6.18%。T₆代播种1536粒,实际出苗1108株,其中1007株筛选得到PPT抗性356株,其它101株直接进行PCR检测。PPT的抗性分离情况除哈白AH-3-1-5-23-10、哈白AH-2-10-46-92-13、哈白BH-1-5-4-12-21、新世纪BL-1-37-72-4-5、潍白AH1-447-49-1-33外,其余均不符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德尔分离规律。PCR检测阳性株44株,阳性率为3.97%。T7代播种918粒,实际出苗580株,其中339株经筛选得到PPT抗性135株,其它241株直接进行PCR检测。PPT的抗性分离情况除了哈白AH-3-1-5-23-2-2外没有符合孟德尔分离规律的植株。PCR检测得到阳性株13株,阳性率仅为2.24%。在Kna抗性筛选过程中,T₅代共播种子772粒,实际出苗378株,筛选得到Kna阳性株226株,Kna抗性分离情况符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德尔分离规律的植株有:哈白EL-1-3-121-11、哈白EL-1-3-47-26、哈白EL-1-3-121-12、哈白EL-1-3-121-1、哈白EL-1-3-47-44、哈白EL-1-3-47-24、哈白EL-1-3-3-4。PCR检测得到阳性株18株,阳性率为4.76%。il-4的分离情况,除哈白EL-1-3-121-11、哈白EL-1-3-47-24植株外,均不符合阳性植株数:阴性植株数=3:1孟德尔分离规律。T₆代共播种子787粒,实际出苗673株,其中660株经Kna筛选得到阳性株192株,其它13株直接进行PCR检测。Kna抗性分离情况都不符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德尔分离规律。PCR检测得到阳性株11株,阳性率仅为1.63%。待测杂交F₁代幼苗225株,直接进行PCR检测得到阳性株5株,阳性率仅为2.22%。远远低于理论值。从PCR检测为阳性的植株中随机抽取7个样品进行PCR-Southern杂交,结果显示被检样品有6株为阳性,表明il-4在转化后代中仍然存在。对其中5株进行Western杂交,其中3株出现杂交条带,更加证明IL-4已经在后代中稳定遗传并表达。对包括杂交株在内的11个阳性样品进行ELISA检测,结果显示,潍白AH1-447-4-2-10占其总可溶性蛋白的含量较高为0.4%,杂交系的TSP值为0.03%。部分样品表达量较低。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
第1章绪论  13-27
  1.1 白细胞介素-4 的研究进展  13-16
    1.1.1 白细胞介素-4 的发现、产生及其分子结构  13
    1.1.2 白细胞介素-4 的基因与受体  13-14
    1.1.3 白细胞介素-4 的生物学功能和临床意义  14-16
  1.2 花粉管通道法研究进展  16-19
    1.2.1 花粉管通道法的创立与发展  16-17
    1.2.2 花粉管通道法机理的研究进展  17-18
    1.2.3 花粉管通道法与其它转化系统的比较  18-19
  1.3 转基因大白菜的研究进展  19-23
    1.3.1 抗病抗虫大白菜的研究进展  19-20
    1.3.2 抗除草剂大白菜的研究进展  20-21
    1.3.3 大白菜基因工程的研究现状  21-22
    1.3.4 大白菜基因工程存在的问题与展望  22-23
  1.4 利用转基因植物生产药用蛋白的研究进展  23-25
    1.4.1 转基因植物生产药用蛋白的研究现状  23-24
    1.4.2 转基因植物生产药用蛋白的特点  24
    1.4.3 转基因植物生产药用蛋白的发展前景  24-25
  1.5 转基因植物的分子检测方法  25-26
    1.5.1 DNA 水平检测  25
    1.5.2 RNA 水平检测  25
    1.5.3 蛋白水平检测  25-26
  1.6 本研究的目的与意义  26-27
第2章转基因大白菜自交、杂交后代的春化、抗性筛选及分析  27-42
  2.1 引言  27
  2.2 试验材料与方法  27-30
    2.2.1 供试材料  27
    2.2.2 药品与试剂  27
    2.2.3 主要仪器与设备  27-28
    2.2.4 试验方法  28-30
  2.3 结果与分析  30-39
    2.3.1 大白菜不同抗性春化处理及育苗结果统计  30-31
    2.3.2 转基因大白菜的适宜PPT、Kna 筛选浓度的确定  31-34
    2.3.3 转基因大白菜后代PPT 抗性筛选及结果分析  34-37
    2.3.4 转基因大白菜后代Kna 抗性筛选及结果分析  37-39
  2.4 讨论  39-40
    2.4.1 温度对大白菜春化的影响  39
    2.4.2 春化天数对大白菜春化的影响  39-40
    2.4.3 影响大白菜春化的相关基因  40
  2.5 大白菜春化存在的问题及展望  40-41
  2.6 本章小结  41-42
第3章转il-4 基因大白菜自交、杂交后代的分子生物学检测与遗传、表达研究  42-72
  3.1 引言  42
  3.2 试验材料与方法  42-54
    3.2.1 试验材料  42
    3.2.2 试验药品与试剂  42-45
    3.2.3 试验主要仪器设备  45
    3.2.4 试验方法  45-54
  3.3 实验结果与分析  54-66
    3.3.1 PPT 抗性T_5 代大白菜幼苗PCR 检测结果与分析  54
    3.3.2 PPT 抗性T_6 代大白菜幼苗PCR 检测结果与分析  54-55
    3.3.3 PPT 抗性T_7 代大白菜幼苗PCR 检测结果与分析  55-56
    3.3.4 Kna 抗性T_5 代大白菜幼苗PCR 检测结果与分析  56-57
    3.3.5 Kna 抗性T_6 代大白菜幼苗PCR 检测结果与分析  57
    3.3.6 杂交F_1 代大白菜幼苗PCR 结果与分析  57-58
    3.3.7 大白菜总DNA 的提取结果与分析  58
    3.3.8 大白菜PCR 检测  58-60
    3.3.9 PCR-Southern 杂交  60
    3.3.10 可溶性蛋白含量的测定  60-61
    3.3.11 大白菜蛋白质的提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳  61-62
    3.3.12 Western 杂交结果  62
    3.3.13 ELISA 检测结果  62-65
    3.3.14 转基因大白菜自交、杂交后代生长势、抗病性比较  65-66
  3.4 讨论  66-71
    3.4.1 关于il-4 基因在大白菜后代传递规律的讨论  66
    3.4.2 转基因沉默  66-67
    3.4.3 外源基因的表达  67-68
    3.4.4 关于制备植物基因组DNA 的讨论  68-69
    3.4.5 关于PCR、PCR-Southern 检测的讨论  69
    3.4.6 关于ELISA、Western 检测的讨论  69-70
    3.4.7 关于大白菜生长势、抗病性及自交不亲和的讨论  70-71
  3.5 本章小结  71-72
结论  72-74
参考文献  74-86
附录  86-87
攻读硕士学位期间发表的学术论文  87-88
致谢  88

转il-4基因大白菜（Brassica pekinensis）及其杂交后代的分子检测及il-4遗传、表达研究

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