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青枯劳尔氏菌PopW蛋白生物学特性及其抗病功能研究

作　者: 李建刚
导　师: 郭坚华
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 青枯劳尔氏菌 popW基因 Harpin 几丁质酶 诱导抗性 生物防治
分类号: S476
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


细菌性青枯病是一种由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solaanacearum, E F Smith)引起的毁灭性土传病害,发病植物茎叶萎蔫下垂直至全部枯死,是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一。青枯劳尔氏菌R. solaanacearum可侵染200多种植物,其中包括生产中重要的作物,如番茄、马铃薯、烟草、花生和香蕉。青枯病菌是一个复杂的群体,有明显的生理分化,不同地区和不同寄主来源的菌株,在寄主范围、致病力、生化型、血清型等细菌学特性上差异很大,因此增加了对此病害防治的难度。近几年来许多科研工作者从不同角度、用不同方法对青枯劳尔氏菌进行了多方面的研究。Harpin蛋白是由革兰氏阴性植物病原细菌Hrp (hrp, hypersensitive response and pathogenity)基因簇中hrp基因编码的、性质和功能相似的一类蛋白质,富含甘氨酸,缺少半胱氨酸,对蛋白酶敏感,对热稳定,大多对寄主植物具有毒性,导致寄主发病,能在非寄主植物上引起过敏反应。本研究以青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ3721的基因组DNA为模板,成功克隆了全长为1143bp的popW基因以及popW(1-159)和popW(160-366)两个基因片段,并把这三个基因连接到表达载体pET30a(+)进行了原核表达。在1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖昔的诱导下(IPTG),这三个基因都能在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达。通过对PopW表达条件的优化发现IPTG的最佳浓度为0.01 mM。运用镍柱纯化获得了高纯度的PopW融合蛋白。另外运用同源重组的方法我们还构建了青枯劳尔氏菌popW基因的插入突变体ZJ3722。我们从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定了一个39.79 KDa的新胞外蛋白PopW,它同以前报道的harpin类物质具有相同的性质,酸性,富含甘氨酸和丝氨酸,缺少半胱氨酸并且是一种耐热蛋白。能在非寄主植物烟草上引起过敏性反应。在一级结构上,PopW是由两个结构域组成,包括N-末端159个氨基酸的harpin结构和C-末端207个氨基酸组成的果胶酶的结构域,他们之间由富含甘氨酸和丝氨酸的短肽连接起来。PopW的harpin结构域也能引起烟草发生HR反应。虽然PopW具有果胶酶结构域,但并没有果胶酶活性。另外,我们从其它十九个不同遗传多样性的青枯劳尔氏菌中都扩增到了popW基因,这说明popW是广泛存在于青枯劳尔氏菌的。把popW和绿色荧光蛋白(GFP)构成融合基因,连接至植物转基因载体pBI121,在土壤杆菌的介导下转入洋葱表皮细胞。荧光显微镜观察结果表明,PopW蛋白是定位在植物的细胞壁上。因此,我们推测PopW在青枯劳尔氏菌与寄主互作的过程中起帮助定殖的作用。通过popW的缺失突变体菌株的接种实验发现popW对非寄主植物烟草的HR反应和寄主植物的致病过程中不起决定作用。综上所述,PopW (39.79 KDa)是青枯劳尔氏菌中广泛存在的一个定位于寄主细胞壁上,受hrpB基因的调控,通过三型泌出系统分泌到胞外的且不影响菌株对寄主致病性的新harpin。对青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum) ZJ 3721中表达的PopW蛋白诱发烟草系统获得抗性进行了研究。以25 gg／mL PopW溶液处理三生烟草叶片24 h后,在处理叶片及其上、下各2片叶片接种TMV,结果显示处理叶及其上、下各2片叶片上的病斑数显著少于只接种水和TMV的对照叶片。同时PopW处理的烟草叶片中还伴随着H202的迸发,在处理后24h时,累积量达到了最大为1.972μM／gFW。另外在此过程中,烟草中还有防御酶系PAL,POD和PPO的时序变化,PAL酶活在12h达到了峰值1215.33U／g,POD和PPO在24h和10h到达了最大值,分别是1110.5U／g和863.67U／g。PopW还能诱导野生型烟草和拟南芥中PR-1基因的表达,而二者转nahG基因的突变体植株却没有该基因的表达。所以PopW能够诱导植物产生系统抗性,并且该抗性属于水杨酸介导的SAR。茄子黄萎病是一种严重的土传维管束病害,本研究发现PopW蛋白能够诱导茄子产生抗性从而防止黄萎病菌的侵染。同时我们从353株茄子根围细菌中筛选到一株产几丁质酶的生防细菌CH2。根据16S rRNA基因序列和生理生化实验确定其为蜡状芽孢杆菌。它能在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长,经SDS-PAGE和特异性底物验证确定其可以向胞外为分泌15KDa的几丁质酶。通过平板实验我们发现,该菌的悬浮液、上清液及其产生的浓度为0.005%几丁质酶液可以有效的抑制黄萎病菌分生孢子的萌发。该菌产生几丁质酶的最适pH值是7.1,最佳温度为40℃。在温室试验中,CH2菌悬液的防效可达69.69%,25μg／mL的PopW蛋白溶液,CH2上清液及0.01%的几丁质酶液的防效分别为57.46%,54.04%和53.13%。所以CH2菌株具有很好的防治茄子黄萎病潜力。

全文目录


摘要  11-13
ABSTRACT  13-16
部分缩略词表  16-18
上篇 文献综述  18-69
  第一章 青枯劳尔氏菌的研究进展  19-27
    1 青枯劳尔氏菌及其危害  19-22
      1.1 青枯劳尔氏菌形态学和生理学特征  19-20
      1.2 青枯劳尔氏菌分类地位  20-21
      1.3 青枯劳尔氏菌的危害  21-22
    2 细菌性青枯病的表现症状  22-24
    3 细菌性青枯病的地理分布  24
    4 青枯劳尔氏菌的致病机理  24-27
  第二章 青枯劳尔氏菌的三型泌出系统  27-39
    1 青枯劳尔氏菌的基因组结构特点  27-28
    2 青枯劳尔氏菌hrp基因簇  28-29
    3 植物病原细菌三型泌出系统的结构  29-32
    4 三型分泌系统的效应蛋白  32-35
    5 青枯劳尔氏菌致病相关基因的调控机制  35-39
  第三章 Harpin蛋白与植物的互作及其分子机理  39-49
    1 Harpin在植物细胞中的作用位点  39-42
    2 Harpin在植物上的效应及其作用机理  42-49
      2.1 Harpin在植物上的有益效应  42-44
        2.1.1 诱导植物抗病性  42-43
        2.1.2 诱导植物抗虫性  43
        2.1.3 诱导植株抗旱反应  43-44
        2.1.4 提高植物产量  44
        2.1.5 减少作物产后损失  44
      2.2 Harpin在植物上作用的信号通路  44-49
        2.2.1 水杨酸信号传导通路  44-46
          2.2.1.1 SA在SAR中的作用  45
          2.2.1.2 SA介导SAR的作用模式  45-46
        2.2.2 茉莉酸/乙烯信号传导通路  46-47
        2.2.3 脱落酸信号传导通路  47-49
  第四章 茄子黄萎病的生物防治研究进展  49-55
    1 茄子黄萎病病原菌概述  49
    2 茄子黄萎病的生物防治研究  49-52
      2.1 生防细菌  50-51
      2.2 生防真菌  51
      2.3 其它生防因子  51-52
    3 几丁质酶在植物病害生物防治中的作用  52-55
      3.1 几丁质酶的种类  52-53
      3.2 几丁质酶在生物防治中的应用  53
      3.3 几丁质酶的生防机理  53-55
  参考文献  55-69
下篇研究内容  69-167
  第一章 青枯劳尔氏菌ZJ3721 popW基因的遗传操作  71-101
    摘要  71
    ABSTRACT  71-73
    第一节 青枯劳尔氏菌ZJ3721 PopW的原核表达  73-91
      1 材料与方法  73-85
        1.1 供试菌株与质粒  73
        1.2 主要试剂  73
        1.3 引物设计与合成  73
        1.4 培养基  73-74
        1.5 缓冲液  74-76
        1.6 青枯劳尔氏菌ZJ3721的特征鉴定  76-77
          1.6.1 生化变种的鉴定  76-77
          1.6.2 fliC-PCR验证  77
        1.7 青枯劳尔氏菌ZJ3721基因组DNA的提取  77-78
        1.8 目的基因的克隆  78-83
          1.8.1 目的基因的PCR扩增及产物纯化  79-80
          1.8.2 PCR产物与克隆载体的连接  80-81
          1.8.3 大肠杆菌感受态的制备  81
          1.8.4 连接产物的转化  81
          1.8.5 质粒提取  81-82
          1.8.6 酶切验证  82-83
        1.9 目的基因的原核表达及纯化  83-85
          1.9.1 pETpopW,pETpopW_((1-159))和pETpopW_((160-366))表达载体的构建及转化  83
          1.9.2 融合蛋白的提取  83
          1.9.3 不同条件下PopW蛋白的表达  83-84
          1.9.4 SDS-PAEG分析  84-85
          1.9.5 PopW融合蛋白的纯化  85
      2 结果  85-91
        2.1 ZJ3721的鉴定结果  85-86
        2.2 popW,popW_((1-159))和popW_((160-366))基因的克隆结果分析  86-89
        2.3 popW,popW_((1-159))和popW_((160-366))基因表达结果的分析  89-90
        2.4 不同条件下PopW蛋白的表达结果  90-91
    第二节 青枯劳尔氏菌ZJ 3721 popW缺失突变体的构建  91-101
      1 材料与方法  91-97
        1.1 供试菌株与质粒  91
        1.2 主要试剂  91
        1.3 引物设计与合成  91
        1.4 培养基  91
        1.5 缓冲液  91-92
        1.6 PCR反应体系和程序  92-93
        1.7 突变载体的构建  93-94
        1.8 电转化感受态细胞的制备  94-95
        1.9 青枯劳尔氏菌的电转化  95
        1.10 popW突变体的Southern杂交分析  95-97
          1.10.1 Southern转移  95-96
          1.10.2 探针的标记  96-97
          1.10.3 预杂交及杂交  97
          1.10.4 免疫检测  97
      2 结果  97-99
        2.1 青枯劳尔氏菌popW基因缺失突变体的菌落形态  97-98
        2.2 青枯劳尔氏菌popW基因缺失突变体的验证  98-99
      3 讨论  99-101
  第二章 青枯劳尔氏菌ZJ3721 PopW蛋白的结构与功能研究  101-123
    摘要  101
    ABSTRACT  101-103
    1 材料和方法  103-114
      1.1 供试菌株与质粒  103
      1.2 主要试剂  103
      1.3 引物设计与合成  103-104
      1.4 培养基  104-107
      1.5 缓冲液  107
      1.6 hrpV和hrpB突变体的构建  107-108
        1.6.1 引物设计与合成  107-108
      1.7 PopW多克隆抗体的制备  108-109
        1.7.1 兔抗血清的制备  108-109
        1.7.2 ELISA法测定效价  109
      1.8 Western Blot  109-110
      1.9 PopW蛋白的热激及蛋白酶K处理  110
      1.10 致病性和HR测验  110
      1.11 PopW亚细胞定位载体的构建  110-113
        1.11.1 popW"基因的PCR扩增  111
        1.11.2 popW"基因与载体的连接  111-112
        1.11.3 阳性克隆的酶切验证  112-113
        1.11.4 土壤杆菌感受态的制备  113
      1.12 土壤杆菌感受态细胞的转化  113
      1.13 土壤杆菌对洋葱表皮的侵染  113
      1.14 PopW果胶酶活性的检测  113-114
      1.15 进化树分析  114
    2 结果  114-121
      2.1 popW编码一种富含甘氨酸的Harpin蛋白  114-115
      2.2 popW在R.solanacearum ZJ3721的致病性及HR活性方面并非必需  115-116
      2.3 PopW是无活性的果胶酶同源物  116
      2.4 PopW全长及其N-末端Harpin结构域都可以引起HR  116-118
      2.5 PopW通过三型泌出系统分泌到胞外  118-119
      2.6 PopW锚定在植物细胞壁上  119-120
      2.7 popW广泛存在于其它青枯劳尔氏菌中  120-121
    3 讨论  121-123
  第三章 青枯劳尔氏菌ZJ3721 PopW蛋白诱导烟草系统获得性研究  123-139
    摘要  123
    ABSTRACT  123-125
    1 材料与方法  125-130
      1.1 植物和微生物材料  125
      1.2 烟草对TMV抗性的测定  125-126
      1.3 H_2O_2的检测  126-127
        1.3.1 H_2O_2的原位检测  126
        1.3.2 H_2O_2含量的测定  126-127
      1.4 PAL活性的测定  127
      1.5 PPO活性的测定  127
      1.6 POD活性的测定  127-128
      1.7 信号通路标志基因表达的检测  128-130
        1.7.1 植物RNA的提取(Trizol法)  128
        1.7.2 sscDNA的合成  128-129
        1.7.3 引物的设计  129-130
    2 结果  130-135
      2.1 PopW能够诱导烟草抵抗TMV的侵染  130-131
      2.2 PopW能够诱导烟草叶片H_2O_2的积累  131-132
      2.3 烟草叶片中PAL活性的变化  132-133
      2.4 烟草叶片中POD活性的变化  133-134
      2.5 烟草叶片中PPO活性的变化  134
      2.6 PopW能够诱导烟草中PR-1基因的表达  134-135
    3 讨论  135-139
  第四章 青枯劳尔氏菌ZJ3721 PopW蛋白与蜡状芽孢杆菌对茄子黄萎病的防治  139-155
    摘要  139
    ABSTRACT  139-141
    1 材料与方法  141-146
      1.1 菌株和培养条件  141
      1.2 产几丁质酶菌株的筛选  141-142
      1.3 菌株对黄萎病菌的拮抗实验  142
      1.4 菌株的鉴定  142-143
      1.5 几丁质酶活的检测  143
      1.6 几丁质酶的纯化  143-144
        1.6.1 粗酶的提取  143-144
        1.6.2 蛋白质层析分离  144
      1.7 几丁质酶的SDS-PAGE分析  144-145
        1.7.1 银染  144-145
      1.8 pH值、温度和贮藏时间对几丁质酶活力的影响  145
      1.9 对V.dahliae分生孢子萌发作用的检测  145
      1.10 温室实验  145-146
      1.11 数据统计  146
    2 结果  146-152
      2.1 菌株的分离  146-147
      2.2 菌株的鉴定  147
      2.3 酶活力测定  147-148
      2.4 几丁质酶的SDS-PAGE分析  148-149
      2.5 温度,pH值和贮存时间对酶活力的影响  149-150
      2.6 对V.dahliae分生孢子萌发的抑制作用  150-151
      2.7 温室实验  151-152
    3 讨论  152-155
  参考文献  155-167
附录一 popW的序列  167-168
附录二 hrpB的序列  168-169
附录三 hrpV的序列  169-171
在读博士期间撰写和发表的学术论文  171-173
致谢  173

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