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紫杉醇长循环免疫脂质体的制备和评价

作　者: 杨涛
导　师: 崔福德；金大德
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: 紫杉醇 乳腺癌 普通脂质体 长循环脂质体 长循环免疫脂质体 赫赛汀 包封率 细胞毒性 药物动力学 相对生物利用度 药效学
分类号: R94
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


由于紫杉醇极低的溶解度，临床上将其增溶在聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇（50:50，v/v）的混合物中用于治疗卵巢癌，乳腺癌，非小细胞肺癌等。然而，该载体会引起许多毒副作用，包括过敏反应，神经毒性，影响了它的临床应用。本论文试图采用脂质体技术将紫杉醇包封在脂质体中以提高紫杉醇的含量，并改善紫杉醇脂质体的稳定性。首先，在紫杉醇普通脂质体的研究过程中，考察了水化介质、胆固醇含量、磷脂含量、药物含量及不同类型的磷脂对紫杉醇脂质体的包封率的影响。结果显示，水化介质中加入3％（v/v）Tween-80能够提高脂质体的稳定性和磷脂薄膜的水化速度。控制磷脂S100PC的浓度为10％（w/v），磷脂与胆固醇的摩尔比为90:10，紫杉醇在处方中为3.5mg/mL，可将紫杉醇在水中的溶解度从大约1μg/mL提高到3.39mg/mL。在水化介质中加入5％（v/v）PEG 400，能够进一步提高脂质体的包封率到89.26％，并能提高紫杉醇在脂质体冻干粉末中的含量。为了进一步改善紫杉醇脂质体的稳定性，将脂质体溶液进行冷冻干燥。蔗糖（蔗糖与磷脂的摩尔比例为2.3:1）作为冻干保护剂，能够保持脂质体在冷冻干燥过程中的完整性。细胞毒性研究显示，紫杉醇脂质体对人的乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞毒性与Taxol?相似。在研究普通紫杉醇脂质体的基础上，为了提高脂质体在体内的循环时间，制备了长循环脂质体。水化介质中加入3％（v/v）Tween-80能够提高紫杉醇在长循环脂质体溶液中的含量到3.28mg/mL，能够满足紫杉醇的临床需求（0.3～1.2 mg/mL）。在冷冻干燥过程中蔗糖的加入提高了长循环脂质体的稳定性，为脂质体的长期储存提供了条件。体外释放研究显示紫杉醇从长循环脂质体中的释放是一个缓慢的过程，24h仅仅释放了33％，明显低于普通脂质体（24h释放了55％）和Taxol?溶液（24h内完全释放）。体外细胞毒性试验显示，经过24h培养，长循环脂质体对MDA-MB-231和SK-BR-3两种人的乳腺癌细胞的细胞毒性比Taxol?弱，但是经过72h的培养，两者显示出相似的细胞毒性。本论文采用后插入法成功的制备了靶向人上皮细胞增长因子2（HER2）高度表达的乳腺癌的长循环免疫脂质体。硫化的抗体能够成功的连接到连接磷脂的远端，并插入到长循环脂质体的磷脂双分子层中。Sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）分析显示抗体赫赛汀（Herceptin）在整个免疫脂质体的制备过程中能够保持结构完整性。同时考察了Herceptin的生物活性，游离的抗体，硫化抗体和连接在免疫脂质体上的抗体对HER2高度表达的乳腺癌细胞（SK-BR-3和BT-474）显示出相似的细胞毒性，确认了生物活性的良好保持。体外释放研究显示，紫杉醇从长循环免疫脂质体中的释放与其从长循环脂质体中的释放无明显的差异（p＞0.05），是一个缓慢的过程，24h仅仅释放了36％。共聚焦激光扫描显微镜研究确认了Herceptin能够使长循环免疫脂质体通过受体介导的内吞进入到HER2高度表达的细胞的内部，然而对于长循环脂质体却不能发现任何的荧光标记。对于BT-474和SK-BR-3细胞，Herceptin与游离的紫杉醇或者脂质体包封的紫杉醇的细胞毒性具有加合作用；长循环免疫脂质体显示出比Herceptin和长循环脂质体联合应用更加强的细胞毒性。通过细胞摄取研究发现，在37℃和HER2高度表达的细胞条件下，通过受体介导的内吞，长循环免疫脂质体显示出比长循环脂质体明显高的细胞摄取率；然而在4℃和HER2低表达的细胞则无显著的差异；该结果与共聚焦激光扫描显微镜研究的结果一致。四种制剂在大鼠体内的药物动力学结果表明，长循环脂质体在体内的循环时间最长，其次为长循环免疫脂质体，再次为普通脂质体，最后为市售紫杉醇剂型Taxol?。以市售紫杉醇剂型Taxol?为参比制剂，紫杉醇普通脂质体的相对生物利用度为160％；长循环脂质体和长循环免疫脂质体的相对生物利用度分别为712.75％和390.83％。接着在MDA-MB-231和BT-474两种动物模型上考察了游离的紫杉醇及紫杉醇脂质体的体内组织分布，对于MDA-MB-231动物模型，长循环脂质体因为拥有最长的体内循环时间，从而在肿瘤部位具有最高的药物累积量，其次为长循环免疫脂质体，再次为普通脂质体，最后为Taxol?。对于BT-474动物模型，长循环免疫脂质体在肿瘤部位的累积量与长循环脂质体无明显差异，再次为普通脂质体，最后为Taxol?。通过建立MDA-MB-231和BT-474两种人的乳腺癌异种移植裸鼠模型，以生理盐水为对照，研究了Taxol?，紫杉醇普通脂质体，长循环脂质体和长循环免疫脂质体的药效学。对于MDA-MB-231裸鼠模型，长循环脂质体和长循环免疫脂质体抗肿瘤效果好，两者间疗效无明显的差异；其次为普通脂质体，再次是Taxol?。对于BT-474裸鼠模型，长循环免疫脂质体的疗效最好，其次为长循环脂质体，再次为普通脂质体，最后为Taxol?。药效学试验结果显示了所制备的紫杉醇脂质体能够显著的改善紫杉醇的抗肿瘤效果，是一种有前途的紫杉醇载体系统。综上所述，本文采用脂质体技术将紫杉醇包封在脂质体中，通过Tween-80的应用，极大地提高了紫杉醇在脂质体溶液中的含量（＞3mg/mL），通过冷冻干燥技术将脂质体冻干，提高了脂质体的稳定性。通过插入聚乙二醇化的磷脂，将脂质体在大鼠体内的平均滞留时间从普通脂质体的3.15h提高到18.75h，延长了脂质体在体内的循环时间。将Herceptin连接到长循环脂质体上后，使其能够主动靶向到HER2高度表达的乳腺癌，药效学研究确认了它能够显著提高紫杉醇的治疗效果，达到了本实验的设计目的。

全文目录


中文摘要  11-13
英文摘要  13-16
前言  16-30
  1.背景  16-17
  2.紫杉醇简介  17-18
   3.当前紫杉醇给药系统的进展  18-21
  4.脂质体的发展  21-24
  5.赫赛汀  24-25
  6.课题的提出  25-26
  7.研究内容  26-27
  参考文献  27-30
第一章 紫杉醇普通脂质体的制备及包封率测定方法的建立  30-51
  1.仪器与试药  30-31
  2.实验方法与结果  31-46
    2.1.紫杉醇脂质体含量及包封率测定方法的建立  31-34
    2.2.紫杉醇脂质体理化性质的测定方法  34-35
    2.3.紫杉醇脂质体处方的优化  35-42
    2.4.蔗糖在脂质体冷冻干燥过程的作用  42-43
    2.5.紫杉醇脂质体处方的细胞毒性  43-46
  3.讨论  46-48
  4.本章小结  48-50
  参考文献  50-51
第二章 紫杉醇长循环脂质体的制备及评价  51-65
  1.仪器与试药  51-52
  2.实验方法  52-55
    2.1.乳腺癌细胞的培养  52
    2.2.长循环脂质体的制备  52
    2.3.脂质体的物理特性  52-53
    2.4.脂质体的体外释放特性  53-55
    2.5.体外细胞毒性  55
  3.试验结果和讨论  55-61
    3.1.处方发展  55-56
    3.2.紫杉醇长循环脂质体的理化性质  56-60
    3.3.体外释放研究  60
    3.4.体外细胞毒性研究  60-61
  4.本章小结  61-63
  参考文献  63-65
第三章 紫杉醇长循环免疫脂质体的制备及评价  65-105
  1.仪器与试药  66-67
  2.实验方法与结果  67-81
    2.1.乳腺癌细胞的培养  67
    2.2.长循环脂质体的制备  67
    2.3.长循环免疫脂质体的制备  67-74
    2.4.SDS-PAGE  74-77
    2.5.长循环免疫脂质体的特色  77
    2.6.长循环免疫脂质体的体外释放  77
    2.7.游离抗体及脂质体连接的抗体的免疫活性  77-78
    2.8.共聚焦激光扫描显微镜  78-79
    2.9.体外细胞毒性研究  79-81
    2.10.紫杉醇脂质体的细胞摄取研究  81
  3.结果  81-99
    3.1.长循环免疫脂质体的制备  81-87
    3.2.长循环免疫脂质体的特色  87-88
    3.3.紫杉醇的体外释放  88-89
    3.4.Herceptin及其连接物的活性  89-90
    3.5.共聚焦激光扫描显微镜  90-93
    3.6.体外细胞毒性  93-96
    3.7.包封在脂质体中的紫杉醇的细胞摄取  96-99
  4.讨论  99-102
  5.本章小结  102-103
  参考文献  103-105
第四章 紫杉醇和紫杉醇脂质体的药物动力学和组织分布的比较  105-127
  1.仪器、试药与动物  105-106
  2.实验方法  106-110
    2.1.给药方法  106-108
      2.1.1.紫杉醇在大鼠体内的动力学  106
      2.1.2.紫杉醇在载有人的乳腺癌的裸鼠身上的分布动力学  106-108
    2.2.生物样品分析  108-110
      2.2.1.色谱条件  108
      2.2.2.血浆样品的处理和测定  108
      2.2.3.组织样品的处理和测定  108
      2.2.4.参数确证  108-110
    2.3.数据处理  110
  3.试验结果  110-122
    3.1.分析方法确证  110-113
    3.2.药物动力学研究数据  113-117
      3.2.1.血药浓度数据  113-115
      3.2.2.四种制剂之间药动学参数的比较  115
      3.2.3.血药浓度—时间曲线  115-117
      3.2.4.相对生物利用度  117
    3.3.组织分布研究  117-122
      3.3.1.在MDA-MB-231裸鼠模型上的组织分布研究  118-120
      3.3.2.在BT-474裸鼠模型上的组织分布研究  120-122
  4.讨论  122-123
  5.本章小结  123-125
  参考文献  125-127
第五章 紫杉醇脂质体的初步药效学考察  127-139
  1.仪器与试药及实验动物  127-128
  2.实验方法  128-130
    2.1.细胞系  128
    2.2.动物  128
    2.3.肿瘤  128-129
    2.4.监控  129
    2.5.治疗  129
    2.6.统计分析  129-130
  3.试验结果  130-135
    3.1.肿瘤体积变化曲线  130-131
    3.2.裸鼠体重变化曲线  131-132
    3.3.肿瘤的百分比  132-134
    3.4.肿瘤的增长抑制(%T/C)  134-135
  4.讨论  135-136
  5.本章小结  136-138
  参考文献  138-139
全文结论  139-142
致谢  142-143
攻读博士学位期间发表论文情况  143

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药剂学
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