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黄瓜霜霉病抗性相关基因筛选及过敏性抗病机制

作　者: 李建武
导　师: 谢从华
学　校: 华中农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 黄瓜霜霉病过敏性反应抑制差减杂交抗病相关基因
分类号: S642.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

黄瓜(Cucumis sativus L.)是国际上第3大蔬菜作物。由Pseudoperonospora cubensis (Berk.et Curt.) Rostow.专性寄生菌引起的霜霉病是瓜类蔬菜生产中一种最具毁灭性的世界性病害,给黄瓜生产造成了非常严重的损失,因此黄瓜霜霉病的防治一直为研究者和生产者所关注。实践证明,培育抗病品种是最经济、环保、高效的途径,而了解和掌握黄瓜霜霉病抗病机制,是寻找培育高效、稳定抗病品种新方法的必由之路。从基因表达整体水平上了解抗病相关基因表达的种类与数量,分析其相互关系,进而研究寄主抗病基因与病原菌的互作,是进行抗病机制研究的有效方法。然而,到目前为止,有关黄瓜霜霉病抗性遗传规律存在争议,黄瓜霜霉病抗性基因调控机制知之甚少。因此,本研究首先评价了42个黄瓜品种(自交系)霜霉病抗性,筛选出高抗霜霉病的黄瓜自交系,选用抑制差减杂交方法(suppression subtractive hybridization, SSH)构建差减文库,应用反向Northern高通量筛选技术筛选出差异表达片段,通过序列和生物信息学分析,确定参与抗病反应的基因数量和功能类别,从形态学、细胞学以及抗病相关基因的表达分析等方面,初步研究了黄瓜抗病自交系与病原菌的互作,为揭示复杂的抗病防御反应分子机理,确定更有效的抗病育种途径,创建稳定的抗性材料提供基础。主要研究结果如下：1.选择有代表性或大面积种植的42个品种(自交系)为材料,采用苗期喷雾接种和成株期田间自然感病的方法,进行3次独立试验,对上述试材霜霉病抗性进行了评价。结果发现,不同品种(自交系)对霜霉病的抗性存在较大差异。病情指数小于2.5为高抗霜霉病的材料,包括IL57、IL102、津春4号、农城4号、中农8号、园丰6号等,这些品种或自交系均属华北类型,其中IL57平均病情指数最小,抗性最强。病情指数大于6为感霜霉病类型,包括IL101、IL112、津优3号、津优30号、新世纪和长春密刺等,其中IL112平均病情指数最大,抗病性最弱。相关性分析发现,黄瓜成株期霜霉病病情指数在不同试验间呈极显著相关,苗期与成株期的病情指数也呈极显著相关,证明苗期抗病性与成株期抗病性一致。因此,选择高抗自交系IL57和感病自交系IL112为后续研究材料。2.以高抗自交系IL57经霜霉病菌接种32、48、56 h后和接种清水对照的叶片为材料,采用SSH技术构建了富集黄瓜霜霉病抗性相关基因的正、反向差减文库。应用反向Northern斑点杂交技术进行筛选,从正、反向差减文库中分别得到了60和26个非重复序列片段(singleton ESTs)。其中,正向差减文库的singleton ESTs涉及12种功能类别和未知功能。按所占比例大小依次为：未知功能、蛋白质合成、细胞运输、初级代谢、转录调控、细胞防御、能量代谢、蛋白质降解、结合功能蛋白、信号传导、次级代谢、细胞周期和DNA加工等。这些功能基因几乎涉及了植物防御病原菌侵染的全部反应过程。反向文库的非重复序列片段涉及9种功能和未知功能,即能量代谢、次级代谢、细胞防御、结合功能蛋白、初级代谢、蛋白质合成、蛋白质降解、细胞运输、信号传导和未知功能等。在病原菌诱导下,下调基因的筛选将为研究黄瓜防御机制提供更全面的信息。在全部86个显著表达的ESTs中,60个来源于正向差减文库,占显著表达ESTs总数的70%,下调特异表达的ESTs仅有30%。比较分析发现,与正向差减文库相比,反向差减文库中有更多的次级代谢和能量代谢相关基因下调显著,表明在霜霉病病原菌胁迫下,黄瓜参与次级代谢和能量代谢基因的表达更多地受到了抑制或破坏。3.根据上述研究结果,选用黄瓜霜霉病的高抗自交系IL57和感病自交系IL112作为黄瓜与病原菌互作研究的试材,采用黄瓜苗期注射接种、喷雾接种以及田间自然感病等方法,观察黄瓜霜霉病病情发展和病斑的形成。观察发现,无论采用何种接种方法,感病自交系IL112感染霜霉病后,病斑呈水浸状、浅绿色。随后病斑面积弥散型急剧扩大,水浸状病斑逐渐失绿。感病后期,水浸状病斑逐渐腐烂。高抗自交系IL57感染霜霉病初期,侵染部位呈水浸状、浅绿色病斑。随着病情的进一步发展,病斑逐渐扩大、失绿,质地变成膜状；菌丝不能穿过叶脉,病斑呈多角型,成熟病斑面积不再扩大,病斑中央穿孔,呈膜状坏死,形成了典型的过敏性病斑。细胞组织化学研究发现,霜霉病侵染黄瓜高抗自交系IL57后,抗病寄主在感病叶片侵染点周围很快产生了大量的H2O2。伴随过敏性反应的发生,侵染点和细胞壁周围沉积了大量胼胝质和木质素。因此,黄瓜抗病自交系与霜霉病互作会发生非亲和反应,迅速形成过敏性病斑,阻碍病情的进一步发展。应用qRT-PCR技术,比较了34个ESTs在非亲和反应和亲和反应中的表达模式。结果表明,抗病相关基因在非亲和反应和亲和反应中存在差异,大部分抗病相关基因在非亲和反应中早期特异表达或表达丰度特异增高。初步推测,在黄瓜与霜霉病的过敏性反应中,可能通过多胺代谢途径生成了H2O2,G蛋白作为信号分子,也许部分调控了H2O2的生成和细胞程序性死亡。与此同时,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、2-型金属硫蛋白、肌醇半乳糖苷和半乳糖苷系列寡糖(raffinose family oligosaccharides, RFOs)或许作为活性氧清除机制的重要成分,保护细胞不受过量活性氧的危害。H2O2可能与木质素氧化交联,激活β-半乳糖苷酶和延伸因子1-alpha基因的表达,导致细胞壁的重排和加厚。泛素-蛋白酶体途径可能参与过敏性反应。此外,转录因子、细胞防御、植保素合成等信号传导和整合,可能最终介导了黄瓜抵御霜霉病的抗病反应。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
缩略词表  12-13
1 文献综述  13-32
  1.1 黄瓜霜霉病概述  14-18
    1.1.1 病原菌基本特征特性  14
    1.1.2 病原菌生理小种分化  14-15
    1.1.3 病原菌保存、苗期鉴定方法和接种浓度  15-16
    1.1.4 霜霉病的症状和流行病学  16-17
    1.1.5 霜霉病危害与防治  17-18
  1.2 黄瓜霜霉病抗病遗传学  18-20
    1.2.1 霜霉病抗性遗传规律  18-19
    1.2.2 霜霉病抗病机制  19-20
  1.3 霜霉病抗病育种  20-23
    1.3.1 抗病种质资源  20-21
    1.3.2 传统杂交选育方法  21
    1.3.3 分子育种技术  21-23
  1.4 植物抗病基因和基因分离方法  23-27
    1.4.1 植物的抗病基因  23-25
    1.4.2 植物基因分离方法  25-26
    1.4.3 抑制差减杂交方法原理与技术  26-27
  1.5 植物—病原相互作用  27-31
    1.5.1 植物抗病基因与病原菌的互作模式  27-28
    1.5.2 过敏性反应与信号传导  28
    1.5.3 防卫反应与ROS信号传导  28-29
    1.5.4 防卫反应与R基因信号传导  29-31
  1.6 本研究的目的与内容  31-32
2 材料与方法  32-46
  2.1 植物材料与病原菌  32
    2.1.1 植物材料  32
    2.1.2 病原菌  32
  2.2 实验方法  32-46
    2.2.1 材料处理方法  32-34
    2.2.2 组织化学染色  34-35
    2.2.3 总RNA抽提及mRNA分离  35-36
    2.2.4 抑制差减杂交  36-39
    2.2.5 差减文库生成  39-40
    2.2.6 差减文库筛选  40-42
    2.2.7 差异表达克隆选取及测序  42
    2.2.8 序列同源性检索  42
    2.2.9 EST测序、检索及功能分类  42
    2.2.10 RT-PCR分析  42-43
    2.2.11 引物设计和荧光实时定量PCR(Real-time quantitative RT-PCR)  43-46
3 结果与分析  46-73
  3.1 黄瓜抗霜霉病材料筛选  46-49
    3.1.1 霜霉病抗性评价  46-47
    3.1.2 本研究霜霉病抗性与已有报道的比较  47-49
    3.1.3 田间自然发病评价和苗期接种评价的相关性  49
  3.2 黄瓜霜霉病抗性基因筛选  49-60
    3.2.1 差减文库构建  49-53
    3.2.2 文库筛选结果  53-55
    3.2.3 差异表达片段的RT-PCR验证  55-56
    3.2.4 测序与同源检索结果  56-57
    3.2.5 基因功能相关分析  57-58
    3.2.6 正向、反向差减文库的比较  58-60
  3.3 黄瓜与霜霉病互作  60-73
    3.3.1 黄瓜抗性材料与霜霉病菌互作产生过敏性反应  60-65
    3.3.2 H_2O_2爆发、胼胝质和木质素的积累  65-68
    3.3.3 抗性相关基因的表达  68-73
4 讨论  73-86
  4.1 抑制差减杂交与反向Northern技术和qRT-PCR相结合分离差异表达基因  73-75
  4.2 过敏性反应与黄瓜霜霉病抗性  75-84
    4.2.1 黄瓜过敏性反应与氧爆发、胼胝质和木质素的积累  75-76
    4.2.2 H_2O_2产生和调节的可能途径  76-78
    4.2.3 相关基因的表达与胼胝质和木质素合成  78-79
    4.2.4 HR与Ubiqutin/proteinsome  79-81
    4.2.5 HR与R-Avr互作引起的抗病防御系统  81-84
  4.3 研究展望  84-86
    4.3.1 黄瓜抗霜霉病基因的深入发掘  84-85
    4.3.2 P.cubnesis生理小种分化的研究  85
    4.3.3 抗病基因与病原菌协同进化  85-86
参考文献  86-102
致谢  102-103
附录  103-114
  附录1 正向差减文库差异片段与已知基因同源性比较结果  103-109
  附录2 反向差减文库差异片段与已知基因同源性比较结果  109-113
  附录3 差减文库所用接头信息  113-114
  附录4 博士在读期间已发表或接受文章  114

黄瓜霜霉病抗性相关基因筛选及过敏性抗病机制

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