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火麻仁蛋白水解及其抗氧化肽的研究

作　者: 林金莺
导　师: 曾庆孝
学　校: 华南理工大学
专　业: 食品科学
关键词: 火麻仁酶解枯草芽孢杆菌液体发酵抗氧化
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

火麻仁作为药食同源作物在我国使用有数千年的历史。火麻仁含20%-25%蛋白质、25%-30%油脂、20%-30%膳食纤维、一系列丰富的维生素和矿物质。火麻仁蛋白质主要含有球蛋白和白蛋白,满足人体所需的各种必需氨基酸,特别富含精氨酸、赖氨酸和谷氨酸。这两种蛋白质易于消化,是一种十分优异的植物蛋白新资源。本论文以火麻仁种仁为原料,通过分步酶解和枯草芽孢杆菌液体发酵两种方法对火麻仁蛋白质进行水解,以不同的方法研究具有较强清除自由基能力的水解物及其纯化多肽,筛选出最佳的水解条件,并研究其潜在的应用价值,从而提高火麻仁蛋白质的生物价值和经济附加值。主要研究结果如下:通过采用超声波加溶剂提取火麻仁油后,再用碱液从火麻仁粕提取蛋白质,可明显提高火麻仁粕粗蛋白的提取率,超声波作用的条件为:功率200 W,提取料液比1:10 (g/mL),空占比20:20 s/s,作用时间为25 min。并通过正交试验,得出其碱液提取蛋白质的最佳条件为:pH 8.5,温度45℃,以1:12 (g/mL)的料液比,提取时间60 min,蛋白质提取率为86.1%,经测定蛋白含量为84.6%。与对照试验比较,蛋白提取率提高约12.2%,提取时间缩短1/3。分别用六种单酶、分步酶解、枯草芽孢杆菌液体发酵火麻仁蛋白质进行比较。发现碱性蛋白酶( Alcalase)是制备抗氧化肽的合适用酶。在分步酶解制备抗氧化肽的研究中,Alcalase酶解5 h接着用木瓜酶酶解3 h得到的酶解物清除自由基的能力,总的来说比只用Alcalase酶酶解效果好一些。除了酶解法,还用枯草芽孢杆菌发酵法制备抗氧化肽,研究结果表明:当初始pH为7.0,底物浓度5%(w/w),红糖粉1.5% (w/w),温度37℃,摇床转速180 r/min, MnSO4. H2O 0.1% (w/w) ,MgSO4.7H2O 0.04%, CaCl2.2H2O 0.04%和NH4Cl 0.1%,发酵时间在42 h-54 h之间的发酵液清除自由基的能力总的来说比其它发酵周期的时间段要好,而48 h时的发酵液对多种自由基的清除率最高以及对油酸过氧化体系的抑制最好。为了比较酶解物(冻干粉)和发酵物(冻干粉)的抗氧化性,在加入亚硝酸钠0.24 mmol/L(溶液浓度)之前,加入发酵物20 mg/mL(溶液浓度),对此引起的氧化褐变,即使在室温下保持60 min,血红蛋白的颜色几乎保持不变,同样,用拉曼光谱仪测定由亚硝酸钠引起血液Fe2+氧化为Fe3+的变化;酶解物2%加上柠檬酸助剂对鸡油的氧化有明显的抑制作用;水解物4 mg/mL对由自由基导致的DNA破坏有明显的保护作用;氨基酸分析结果表明发酵物中游离精氨酸占总量的4.44%。为了研究水解物及其纯化多肽对自由基清除能力的评价,采用了IC50值进行比较,结果表明经过分离纯化的多肽比它们相对应的水解物清除自由基的能力强,且发酵物纯化多肽(F2)比酶解物纯化多肽(E2)的强。纯化酶解多肽(E2)对DPPH,HO˙,O2·-, Fe2+的清除率IC50值分别是2.01 mg/mL,0.6 mg/mL,3.21 mg/mL和1.12 mg/mL ,而纯化发酵多肽(F2)的IC50值分别是1.73 mg/mL,0.44 mg/mL,2.89 mg/mL和0.88 mg/mL。采用飞行离子色谱测定分离的具有较强抗氧化特性的多肽氨基酸顺序及分子量,纯化酶解多肽(E2):Phe-Leu-Lys-Leu-Thr-Ala-Glu-Arg (MW=997.4924Da),而纯化发酵多肽:Arg-Ser-Arg-Lys-Gly-Phe-Glu-Trp-Leu-Arg-Val-Lys (MW=1306.7063 Da)。这两个结构独特的多肽具有很明显抑制脂肪过氧化的能力。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章绪论  14-31
  1.1 研究背景  14-18
    1.1.1 火麻仁种子  14-15
    1.1.2 火麻仁的营养成分以及应用  15-18
  1.2 多肽简述  18-20
  1.3 抗氧化肽的研究进展  20-25
    1.3.1 抗氧化肽的研究进展  20-21
    1.3.2 人体自由基产生的原因  21-22
    1.3.3 多肽抗氧化原理  22-25
  1.4 多肽的制备  25-27
    1.4.1 抗氧化肽制备方法介绍  25-26
    1.4.2 抗氧化肽的分离纯化  26-27
    1.4.3 抗氧化能力的评价  27
  1.5 本研究的意义和内容  27-31
    1.5.1 开发利用火麻仁蛋白的意义  27-28
    1.5.2 本研究的立项依据和主要研究内容  28-31
第二章超声波辅助火麻仁蛋白提取的研究  31-45
  2.1 前言  31-32
  2.2 材料与方法  32-35
    2.2.1 试验材料和试剂  32
    2.2.2 主要设备  32-33
    2.2.3 试验方法  33-34
    2.2.4 测定方法  34-35
  2.3 结果与讨论  35-44
    2.3.1 火麻仁油脂和蛋白含量  36
    2.3.2 火麻仁蛋白质的等电点  36-37
    2.3.3 超声波前处理对火麻仁粕蛋白提取单因素的探讨  37-42
    2.3.4 火麻仁蛋白质的理化性质  42-44
  2.4 本章小结  44-45
第三章枯草芽孢杆菌改进火麻仁多肽抗氧化性的研究  45-74
  3.1 前言  45-47
  3.2 材料与方法  47-57
    3.2.1 试验材料  47
    3.2.2 主要生物和化学试剂  47
    3.2.3 主要仪器设备  47-48
    3.2.4 枯草芽孢杆菌发酵方法  48-50
    3.2.5 枯草芽孢杆菌制备多肽的工艺流程  50
    3.2.6 枯草芽孢杆菌制备抗氧化肽条件的研究  50-51
    3.2.7 测定方法  51-57
  3.3 结果与讨论  57-72
    3.3.1 发酵条件对多肽得率的研究  57-64
    3.3.2 发酵液多肽和氨基肽氮得率  64-65
    3.3.3 发酵液清除自由基的研究  65-69
    3.3.4 发酵物多糖含量  69-70
    3.3.5 蛋白酶活力  70
    3.3.6 HPLC 测定发酵液的多肽峰  70-72
  3.4 本章小结  72-74
第四章酶解制备火麻仁抗氧化肽与酶解关系的研究  74-92
  4.1 前言  74-75
  4.2 材料与方法  75-78
    4.2.1 试验材料  75-76
    4.2.2 试验方法  76-77
    4.2.3 测定方法  77-78
  4.3 结果与讨论  78-90
    4.3.1 单酶酶解结果  78-85
    4.3.2 分步酶解结果  85-90
  4.4 本章小结  90-92
第五章火麻仁酶解物和发酵物清除自由基的研究  92-110
  5.1 前言  92
  5.2 材料与方法  92-96
    5.2.1 材料与试剂  92
    5.2.2 主要仪器设备  92-93
    5.2.3 试验方法  93-96
  5.3 结果与讨论  96-108
    5.3.1 清除自由基的研究  96-97
    5.3.2 对紫外线吸收的研究  97-98
    5.3.3 对血球保护的研究  98-100
    5.3.4 对血红蛋白保护的研究  100-103
    5.3.5 对延长鸡油保质期的研究  103-105
    5.3.6 氨基酸分析  105-108
  5.4 本章小结  108-110
第六章抗氧化多肽的纯化与测定  110-120
  6.1 前言  110
  6.2 材料与方法  110-111
    6.2.1 试验材料  110
    6.2.2 主要设备  110
    6.2.3 测定分析  110-111
  6.3 结果与讨论  111-118
    6.3.1 HPLC 分析酶解物和发酵物的多肽峰  111-112
    6.3.2 多肽对自由基清除能力的分析  112-114
    6.3.3 多肽分子量的分析  114-116
    6.3.4 纯化多肽对油酸过氧化体系抑制的分析  116-117
    6.3.5 纯化多肽对DNA 的保护作用  117-118
  6.4 本章小结  118-120
结论与展望  120-125
  一、主要结论  120-122
  二、本文的创新之处  122
  三、今后工作的展望  122-125
参考文献  125-143
攻读博士学位期间取得的研究成果  143-144
致谢  144-145
附件  145

火麻仁蛋白水解及其抗氧化肽的研究

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