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鳕鱼免疫活性肽的可控制备及其免疫活性研究

作　者: 侯虎
导　师: 李八方
学　校: 中国海洋大学
专　业: 食品科学
关键词: 鳕鱼 可控酶解 免疫活性肽 生物传感器 神经网络 分离纯化 氨基酸 脱盐
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


免疫活性肽是一类具有增强机体免疫力、增强巨噬细胞吞噬功能、提高机体抵御外界病原体感染能力等免疫功能的肽,具有分子量小、稳定性强,且免疫原性弱、生物活性高等诸多优点。目前酶法制备生物活性肽主要集中在活性优化和动力学模拟上,并不能保证酶解按预期进行。而鳕鱼免疫活性肽的可控制备及免疫活性研究,是通过采用生物技术、生物传感器、数学模型、人工神经网络等实现了免疫活性肽的准确预测、动态监测、可控制备,并且利用树脂吸附技术等对免疫活性肽精制,为免疫活性肽的工业化生产提供理论依据和技术支持。同时本文还对制备的鳕鱼免疫肽的体内免疫活性机理作了初步探讨。本论文形成了以下研究成果:1、本文以鳕鱼加工下脚料鳕鱼排为原料作为研究对象,首先研究了其基本组成。鳕鱼排中蛋白质含量较高(18.4%),以碱溶性蛋白(35.49%)和基质蛋白(30.49%)为主,有重要利用价值。鳕鱼排蛋白中以高含量的甘氨酸(26.51%)和谷氨酸(12.57%)为主,其次为丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸和赖氨酸。为了充分利用鳕鱼蛋白,对鳕鱼排进行了软化高压预处理研究,条件最终设定为120℃处理30min。2、水解度值、分子量分布、多肽含量均是反映酶解产物特征的重要因素,但在线监测困难。鳕鱼蛋白酶解产物游离氨基酸含量呈现规律性变化,可作为监测水解反应的响应因子,并且生物传感器测定响应因子速度快、准确度高、稳定性好。其中对谷氨酸和赖氨酸测定的相对误差分别为1.5%和1.0%,变异系数分别为3.85%和3.03%,标准偏差分别为0.78和0.60。多酶切位点下,游离谷氨酸和赖氨酸都呈规律性变化,与水解度正相关,可作为酶解产物的响应因子,同时在一定水解度范围内,游离谷氨酸和赖氨酸浓度与水解度均呈现较好的线性关系。利用游离谷氨酸和赖氨酸浓度作为响应因子监测多种商品酶的水解程度是可行的。3、鳕鱼排的胰酶水解产物(PFH)可以显著促进脾细胞增殖、T细胞增殖、巨噬细胞吞噬(p<0.05)。分子量和水解度是影响脾细胞增殖活性的重要因素。在水解度15-18%时,PFH的脾细胞增殖活性最高。采用响应面方法确定了鳕鱼免疫肽制备参数:蛋白浓度25g/L、pH值8.0、温度(50±1)℃、时间290 min和加酶量24 U/mg,验证实验的平均DH为16.87%,脾淋巴细胞平均增殖率为28.45%,与理论值相符。PFH在220nm和280nm处有较大吸收峰,氨基酸组成以脯氨酸(15.69%)含量最高。PFH在广泛的pH范围具有较好的溶解性,在温度20-60℃范围PFH具有较低的粘度; pH对PFH的起泡性、乳化性影响较大。PFH在胃蛋白酶、胰蛋白酶和复合酶条件下会发生部分降解,但主要多肽成分的变化很小。4、在严格控制水解条件下,动力学模型在一定范围内可以很好的预测反应的进行。鳕鱼蛋白的胰酶水解的动力学模型为:R= (0.1693 E0– 0.2816 S0) exp│-0.357 * DH│,DH= 2.801 ln│1 + (0.06044 E0/S0– 0.1005)t│,胰蛋白酶的失活动力学常数为0.0512 min-1。鳕鱼免疫肽恒定条件时的预测模型:DH= 2.801 ln [1+ 1.35006t],可以通过预测曲线,获得免疫肽的制备时间。这对鳕鱼免疫活性肽制备有十分重要的意义。验证试验表明,当条件恒定时,实现了鳕鱼免疫肽制备的预测性,且模型理论值与实际值相符。但是当条件改变时,如搅拌速率的变化、温度的波动,显著的影响了最终反应产物,模型理论值与实际值不符。5、利用生物传感器,实现了恒定条件和动态条件下鳕鱼免疫制备的监控。恒定条件下,水解度在11-18%时,与游离赖氨酸、谷氨酸呈现很好的线性关系,方程式分别为:DH = 0.2225[Glu] - 5.3097,DH = 0.0126[Lys] - 1.2275。当初始酶浓度或初始底物浓度改变时,谷氨酸、赖氨酸的响应浓度与水解度数学关系不明确,呈现无规律的曲线关系。尽管不能用统一的数学模型确定动态变化的水解反应,但是其反应临界值符合很好的的线性关系,可以用以下公式来表示:[Glu] = 0.8186 [S0] + 0.0346 [E0] + 0.4506,[Lys] = 0.7430 [S0] + 0.1370 [E0] + 5.2931。6、本文利用人工神经网络(BP-ANNs)和生物传感器,建立了三个可在动态变化条件下实现在线监测的网络模型分别为:GLU-BP-ANNs的动态监控模型,LYS-BP-ANNs的动态监控模型,GLU-LYS- BP- ANNs的动态监控模型。三个模型的样本值与拟合值进行比较分析可知,R2值分别为0.9967、0.9964、0.9967,拟合误差范围分别为0-4.14%、0-4.56%、0-4.71%,拟合平均相对误差值分别为1.06%、0.94%、0.99%。利用模型进行五次独立的验证实验,理论值与实验值相符合,试验的相对误差范围分别为0.23%-2.81%,0.26%-1.91%和0.30%-2.35%。三个模型在一定程度上实现了仿真监控,均可以用来监测水解反应的进程。三个网络监控模型的共性参数如下:隐含层为1层,输入层与隐层之间使用logsig传递函数,隐层与输出层之间使用线性purelin函数,网络训练函数采用trainlm,适应性学习函数采用learngdm。GLU-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、游离谷氨酸浓度[Glu];输出层节点为DH;隐层节点数为10。LYS-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、终产物的赖氨酸浓度[Lys];输出层节点为DH;隐层节点数为11。GLU-LYS-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、终产物的[Lys]和[Glu];输出层节点为DH;隐层节点数为8。7、利用Sephadex G-25凝胶柱层析、阳离子色谱、反相高效液相色谱对鳕鱼免疫肽混合成分反复纯化,获得了三个免疫活性肽,并利用反相高效液相色谱C18分析柱纯度鉴定,得到单一对称的单峰。利用Nano-ESI-Ms/Ms分别对三个活性肽进行结构表征。免疫肽Y3的分子量为583.9922Da,为五肽,肽序列为Asn– Gly– Met– Thr– Tyr,在20μg/mL时的脾细胞平均增殖率分别为35.92%。免疫肽H2的分子量为470.1422Da,其肽序列为Asn– Gly– Leu– Ala– Pro,为五肽,在浓度20μg/mL时,脾淋巴细胞增殖率平均值为32.96%。免疫活性肽S4的分子量为305.1622Da,为二肽,其序列为Trp– Thr,在浓度20μg/mL时,脾淋巴细胞增殖率平均值为31.35%。8、本文进一步研究了PFH对正常小鼠、免疫低下小鼠的免疫机理。PFH能显著提高正常小鼠的淋巴细胞转化活性(p<0.05)、迟发型变态反应(p<0.05)和单核巨噬细胞的吞噬能力(p<0.05),而对免疫器官指数和血清溶血素的影响较小(p>0.05)。对于免疫功能低下小鼠,PFH能显著提高小鼠的免疫器官指数(P<0.05);显著促进小鼠的迟发型变态反应(p<0.05),提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P<0.05),提高小鼠的细胞免疫功能;提高血清溶血素含量(P<0.05),促进小鼠的体液免疫功能;显著促进小鼠的碳廓清能力(P<0.01)和腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数(P<0.05, P<0.01),促进小鼠的非特异性免疫功能。9、在免疫肽的精制中,DA201-C树脂对PFH的吸附能力最强,静态吸附最佳条件为:温度25℃,pH 4.0,多肽浓度10 mg/mL,树脂质量与多肽体积比(g/mL) 2:1,吸附时间3 h,吸附率可达84.7%。乙醇浓度为50%(?)时,静态解析率最高为82.7%。动态吸附与解析得到的脱盐多肽,脱盐率为98.1%,多肽回收率为90.3%。脾细胞增殖实验表明DA201-C树脂脱盐后的多肽仍具有促进脾细胞增殖活性。

全文目录


摘要  5-9
Abstract  9-14
英文缩略语表  14-26
第一章 文献综述  26-63
  1 生物活性肽的研究进展  26-33
    1.1 生物活性肽的概述  26
    1.2 生物活性肽的分类  26
    1.3 生物活性肽的功能  26-30
    1.4 生物活性肽的来源与制备方法  30-33
  2 免疫活性肽的研究现状  33-36
    2.1 免疫活性肽概述  33-34
    2.2 免疫活性肽的来源及研究进展  34-35
    2.3 免疫肽的研究前景  35-36
  3 可控酶解蛋白质的研究进展  36-39
    3.1 酶促动力学模型的研究进展  37
    3.2 蛋白质酶解工艺的研究进展  37-38
    3.3 可控酶解的研究前景  38-39
  4 生物活性肽的分离鉴定研究进展  39-43
    4.1 生物活性肽的分离纯化  39-42
    4.2 生物活性肽的鉴定方法  42-43
  5 生物传感器  43-49
    5.1 生物传感器概述  43-45
    5.2 酶生物传感器  45-47
    5.3 生物传感器在食品与发酵工业的应用  47-49
    5.4 生物传感器在生物活性肽生产中的前景  49
  6 人工神经网络概述  49-52
    6.1 人工神经网络  49-51
    6.2 BP 神经网络  51-52
  7 本课题研究的目的意义和主要内容  52-54
    7.1 本课题研究的立项背景和意义  52-53
    7.2 本文研究的主要内容  53-54
  参考文献  54-63
第二章 鳕鱼骨架基本组成研究  63-76
  引言  63
  1 材料与仪器  63-64
    1.1 实验材料  63
    1.2 实验仪器  63-64
  2 实验方法  64-67
    2.1 鳕鱼排基本成分的测定  64-65
    2.2 鳕鱼排与鳕鱼肌肉分离蛋白组成的测定  65-66
    2.3 氨基酸组成的测定  66
    2.4 脂肪酸组成的测定  66
    2.5 矿物质元素组成分析  66-67
    2.6 鳕鱼排软化研究  67
  3 结果与分析  67-73
    3.1 基本成分分析  67-68
    3.2 分离蛋白组成分析  68-69
    3.3 氨基酸组成分析  69-70
    3.4 APF 的脂肪酸组成  70-72
    3.5 APF 的矿质元素组成  72
    3.6 APF 的高压预处理  72-73
  4 本章小结  73
  参考文献  73-76
第三章 鳕鱼蛋白酶解反应中响应因子的研究  76-96
  引言  76-77
  1 材料与方法  77-78
    1.1 实验材料  77
    1.2 实验仪器  77
    1.3 实验试剂  77-78
  2 实验方法  78-82
    2.1 蛋白酶活力的测定  78-79
    2.2 底物鳕鱼排制备流程  79
    2.3 鳕鱼排酶解工艺流程  79
    2.4 水解度的测定  79-81
    2.5 氮回收率的测定  81
    2.6 水解产物分子量的测定  81
    2.7 氨基酸态氮的测定  81
    2.8 Glu 和Lys 含量的测定  81-82
    2.9 数据分析  82
  3 结果与分析  82-94
    3.1 酶的反应参数  82-83
    3.2 不同蛋白酶水解效率比较  83-85
    3.3 不同蛋白酶对APF 蛋白水解物中氨基氮的影响  85-86
    3.4 APF 蛋白的游离氨基酸含量及变化  86-88
    3.5 酶切位点对生物传感器响应因子的影响  88-92
    3.6 酶切位点对响应因子的回归的影响  92-94
  4 小结  94
  参考文献  94-96
第四章 鳕鱼免疫活性肽的制备及性质研究  96-129
  引言  96-97
  第一节 鳕鱼水解物免疫活性的比较及体外免疫方法的确立  97-107
    1 材料与仪器  97
      1.1 材料  97
      1.2 仪器  97
      1.3 试剂  97
    2 方法  97-100
      2.1 试剂的配制  97-98
      2.2 样品制备  98
      2.3 脾淋巴细胞增殖实验  98-99
      2.4 ConA 诱导T 细胞增殖实验  99
      2.5 巨噬细胞吞噬中性红能力测定  99
      2.6 数据处理  99-100
    3 结果与讨论  100-106
      3.1 脾淋巴细胞增殖  100-101
      3.2 水解物对ConA 诱导的T 细胞增殖的影响  101-102
      3.3 水解物对巨噬细胞增殖的影响  102-103
      3.4 不同酶的酶解效率比较  103-104
      3.5 影响APF 胰酶水解物免疫活性的因素  104-106
    4 小结  106-107
  第二节 鳕鱼免疫活性肽的工艺优化  107-113
    1 材料与仪器  107
      1.1 材料  107
      1.2 仪器  107
      1.3 试剂  107
    2 方法  107-108
      2.1 试剂的配制  107
      2.2 样品制备  107-108
      2.3 水解度的测定  108
      2.4 脾细胞增殖活性测定  108
    3 结果与分析  108-112
      3.1 鳕鱼排免疫活性肽工艺优化  108-112
      3.2 鳕鱼排免疫活性肽的验证试验  112
    4 小结  112-113
  第三节 鳕鱼排免疫活性肽的理化性质研究  113-126
    1 材料与仪器  113
      1.1 材料  113
      1.2 仪器  113
    2 实验方法  113-116
      2.1 PFH 的紫外光谱  113
      2.2 PFH 氨基酸组成分析  113
      2.3 PFH 的功能性质  113-115
      2.4 PFH 的稳定性测定  115-116
      2.5 HPLC 分析  116
    3 结果与分析  116-126
      3.1 PFH 的紫外图谱  116-117
      3.2 PFH 的氨基酸组成分析  117-118
      3.3 PFH 的功能性质分析  118-123
      3.4 PFH 的稳定性  123-126
    4 小结  126
  参考文献  126-129
第五章 基于生物传感器的鳕鱼免疫肽过程控制研究  129-169
  引言  129-130
  第一节 鳕鱼免疫肽动力学预测模型  130-139
    1 材料与仪器  130
      1.1 材料  130
      1.2 仪器  130
    2 实验方法  130
      2.1 酶活的测定  130
      2.2 水解度的测定  130
    3 结果与分析  130-137
      3.1 胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白的动力学机制  130-131
      3.2 胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白的酶解曲线  131-133
      3.3 胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白动力学模型参数的确定  133-134
      3.4 胰蛋白酶失活常数的确定  134-135
      3.5 胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白动力学模型的验证  135-137
    4 小结  137-139
  第二节 鳕鱼免疫肽酶解的数学监控模型  139-147
    1 材料与仪器  139
      1.1 材料  139
      1.2 仪器  139
    2 实验方法  139
      2.1 酶活的测定  139
      2.2 水解度的测定  139
      2.3 Glu 和Lys 含量的测定  139
    3 结果与分析  139-146
      3.1 恒定条件下鳕鱼免疫肽的监控数学模型  139-143
      3.2 动态条件下鳕鱼免疫肽的监控关系  143-146
    4 小结  146-147
  第三节 基于人工神经网络的鳕鱼免疫肽动态监控模型  147-167
    1 材料与仪器  148
      1.1 材料  148
      1.2 仪器  148
    2 实验方法  148
      2.1 酶活的测定  148
      2.2 水解度的测定  148
      2.3 Glu 和Lys 含量的测定  148
    3 结果与分析  148-166
      3.1 GLU-BP-ANNs 的动态监控模型  148-156
      3.2 LYS-BP-ANNs 的动态监控模型  156-161
      3.3 GLU-LYS-BP-ANNs 的监控模型  161-166
    4 小结  166-167
  参考文献  167-169
第六章 鳕鱼免疫活性肽的分离纯化及结构表征  169-181
  引言  169-170
  1 材料与仪器  170
    1.1 实验材料  170
    1.2 仪器  170
  2 实验方法  170-172
    2.1 SP Sephadex C25 阳离子交换柱层析  170
    2.2 Sephadex G15 凝胶柱脱盐  170
    2.3 Sephadex G25 凝胶柱层析  170-171
    2.4 反相高效液相色谱C18 半制备柱纯化制备  171
    2.5 脾细胞增殖活性  171
    2.6 免疫活性肽的结构鉴定  171-172
    2.7 数据处理  172
  3 结果与分析  172-180
    3.1 SP Sephadex C25 阳离子交换柱层析分离免疫肽  172-173
    3.2 Sephadex G25 凝胶柱层析分离C5 组分  173-174
    3.3 反相高效液相色谱对活性肽纯化  174-180
  4 小结  180
  参考文献  180-181
第七章 PFH 对小鼠体内免疫活性的影响  181-199
  引言  181-182
  第一节 PFH 对正常小鼠免疫活性的影响  182-190
    1 实验材料与仪器  182
      1.1 实验材料  182
      1.2 仪器  182
      1.3 试剂  182
    2 实验方法  182-185
      2.1 试剂的配制  182-183
      2.2 实验动物分组与喂养  183
      2.3 器官指数  183
      2.4 迟发型变态反应  183-184
      2.5 小鼠脾淋巴细胞转化实验  184
      2.6 血清溶血素的测定  184-185
      2.7 巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验  185
      2.8 数据处理  185
    3 结果与讨论  185-189
      3.1 PFH 对正常小鼠体重和脏器指数的影响  185-187
      3.2 PFH 对正常小鼠细胞免疫功能的影响  187-188
      3.3 PFH 对正常小鼠体液免疫功能的影响  188
      3.4 PFH 对正常小鼠单核巨噬细胞免疫功能的影响  188-189
    4 小结  189-190
  第二节 PFH 对免疫低下小鼠免疫活性的影响  190-197
    1 材料与仪器  190
      1.1 实验材料  190
      1.2 仪器  190
      1.3 试剂  190
    2 实验方法  190-192
      2.1 PFH 对免疫低下小鼠免疫功能的影响  190-191
      2.2 脏器指数  191
      2.3 血清溶血素的测定  191
      2.4 迟发型变态反应  191
      2.5 巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验  191
      2.6 小鼠脾淋巴细胞转化实验  191
      2.7 小鼠碳廓清实验  191-192
      2.8 数据处理  192
    3 结果与讨论  192-196
      3.1 PFH 对免疫低下小鼠脏器指数的影响  192-193
      3.2 PFH 对免疫低下小鼠细胞免疫功能的影响  193-194
      3.3 PFH 对免疫低下小鼠体液免疫功能的影响  194-195
      3.4 PFH 对免疫低下小鼠单核巨噬细胞免疫功能的影响  195-196
    4 小结  196-197
  参考文献  197-199
第八章 鳕鱼免疫活性肽的精制研究  199-211
  引言  199-200
  1 材料与仪器  200-201
    1.1 实验材料  200
    1.2 实验仪器  200-201
  2 实验方法  201-202
    2.1 大孔吸附树脂预处理  201
    2.2 静态吸附实验  201-202
    2.3 静态解析实验  202
    2.4 动态吸附与解吸实验  202
    2.5 脱盐率的测定  202
    2.6 MTT 法测定脾淋巴细胞增殖  202
  3 结果与分析  202-208
    3.1 大孔吸附树脂的筛选  202-203
    3.2 DA201-C 树脂的吸附动力学曲线  203-204
    3.3 pH 对DA201-C 树脂吸附的影响  204
    3.4 多肽浓度对DA201-C 树脂吸附的影响  204-205
    3.5 温度对DA201-C 树脂吸附的影响  205
    3.6 料液比对DA201-C 树脂吸附的影响  205-206
    3.7 DA201-C 树脂的静态解析  206
    3.8 DA201-C 树脂的动态吸附与解析  206-207
    3.9 DA201-C 树脂的吸附及脱盐分析  207-208
    3.10 脾细胞增殖实验  208
  4 小结  208-209
  参考文献  209-211
结论  211-214
本论文创新点  214-215
个人简历  215
博士期间发表的研究成果  215-217
致谢  217

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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