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高表达Mn-SOD肝细胞模型的构建及应用

作　者: 王智勇
导　师: 龚兴国
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 活性氧 Mn-SOD 肝细胞(HepG2) 细胞色素c Akt通路
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

活性氧物质（ROS）是生物体内氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物的总称,与细胞凋亡、细胞周期、信号转导,细胞分化、衰老等很多生理学现象密切相关,一般被认为是具有有害和有利双重作用的。过度的氧化应激将导致细胞的坏死,而适度的氧化应激则诱导细胞增殖。ROS处于一个动态平衡中是其行使正常功能所必须,其中超氧阴离子（O₂^-）是胞内氧化压力的重要来源,并能通过反应转化为其他各类ROS。作为活性氧的一种清除剂,超氧化物歧化酶能够催化超氧阴离子O2.-反应生成H₂O₂和水,在降低胞内O2.-水平和胞内氧化压力起到重要的作用,尤其是位于线粒体的Mn-SOD,是清除ROS第一道防线,几乎任何癌的Mn-SOD都明显低于正常,而且也有研究表明Mn-SOD可提高细胞对氧应激反应的耐受性。在本研究中,我们通过转染含有Mn-SOD的真核表达质粒进入肝细胞HepG2,构建出高Mn-SOD表达的肝细胞模型,证明Mn-SOD在双氧水的刺激下对线粒体活性存在保护作用,具有较高Mn-SOD水平的细胞相对Mn-SOD缺乏的细胞而言具有对双氧水的细胞毒性更好的抵抗作用。此外,我们用流式细胞仪检测转染Mn-SOD对细胞中ROS水平和细胞周期的影响,为了寻找Mn-SOD抗氧化作用的具体信号通路,我们用Western检测了Akt的磷酸化的状态,用RT-PCR检测了转录因子的表达水平。实验显示,Mn-SOD的高表达抑制Akt的磷酸化和降低氧化敏感转录因子c-Fos/c-Jun和p65的表达水平,这些结果表明Mn-SOD通过降低ROS水平,调节Akt的磷酸化从而抑制转录因子c-Fos/c-Jun and p65的表达,终致抗氧化能力的提高。

全文目录

致谢  5-6
缩写  6-10
摘要  10-11
ABSTRACT  11-12
第1章论文综述  12-34
  前言  12
  1.1 活性氧的种类与来源  12-13
    1.1.1 种类  12
    1.1.2 来源  12-13
  1.2 活性氧的清除  13-16
    1.2.1 生物抗氧化酶  13-14
    1.2.2 生物抗氧化剂  14-16
  1.3 活性氧对细胞的调控作用  16-22
    1.3.1 ROS对细胞内氧化还原状态的调控  16-17
    1.3.2 ROS对细胞周期的调节作用  17-18
    1.3.3 ROS对蛋白的氧化修饰  18-19
    1.3.4 ROS调控细胞凋亡  19-20
    1.3.5 ROS对转录因子活化的刺激作用  20
    1.3.6 活性氧对不同信号分子的影响总结如下  20-22
  1.4 活性氧在细胞内的动态平衡  22-23
  1.5 MN-SOD对活性氧的清除作用  23-28
    1.5.1 Mn-SOD结构与功能  23-24
    1.5.2 自由基损伤理论  24-25
    1.5.3 Mn-SOD和活性氧的平衡  25-27
    1.5.4 Mn-SOD的应用  27-28
  1.6 AKT信号通路  28-29
  1.7 参考文献  29-34
第2章高表达MNSOD肝细胞模型的构建  34-50
  前言  34-35
  2.1 实验材料及试剂  35-38
    2.1.1 质粒菌种  35-36
    2.1.2 酶与抗体  36
    2.1.3 分子量标准  36
    2.1.4 试剂盒来源  36
    2.1.5 缓冲液及其他溶液配方  36-37
    2.1.6 其他主要试剂和商品来源  37-38
  2.2 实验主要仪器  38-39
  2.3 实验方法和步骤  39-45
    2.3.1 细胞培养  39
    2.3.2 质粒转化及扩增  39-41
    2.3.3 脂质体2000转染  41
    2.3.4 G418筛选  41-42
    2.3.5 单克隆挑取  42
    2.3.6 半定量RT-PCR鉴定MnSOD表达差异  42-43
    2.3.7 Western blotting检测细胞内Mn-SOD含量的变化  43-45
  2.4 实验结果与分析  45-47
    2.4.1 MnSOD在mRNA水平的表达差异  45-46
    2.4.2 Mn-SOD在蛋白水平的表达变化  46-47
  2.5 实验讨论  47-48
  2.6 参考文献  48-50
第3章高表达MNSOD肝细胞模型的应用  50-64
  前言  50-51
  3.1 实验材料和仪器  51-52
    3.1.1 主要试剂  51
    3.1.2 主要实验仪器  51-52
  3.2 实验方法和步骤  52-54
    3.2.1 流式细胞术(FCM)检测细胞ROS变化  52
    3.2.2 流式细胞仪检测细胞周期变化  52-53
    3.2.3 MTT法测定H_2O_2处理下肿瘤细胞生长抑制率与增殖率。  53
    3.2.4 Western blotting测细胞内cyt c的释放  53
    3.2.5 半定量RT-PCR检测转录因子的变化  53-54
    3.2.6 统计学处理  54
  3.3 实验结果与分析  54-60
    3.3.1 高表达MnSOD对HepG2内ROS水平的调控  54-55
    3.3.2 高表达Mn-SOD升高HepG2在G1期内的比例  55-56
    3.3.3 高表达Mn-SOD提高HepG2对双氧水的耐受能力  56
    3.3.4 高表达Mn-SOD减少细胞色素c在细胞内的释放  56-57
    3.3.5 Mn-SOD对Akt的磷酸化的调节  57-58
    3.3.6 高表达Mn-SOD下调转录因子AP-1和NF-κB表达  58-60
  3.4 实验讨论  60
  3.5 参考文献  60-64
第4章实验总结  64-65
  4.1 创新点  64
  4.2 总结和展望  64-65
附录  65
  研究生期间论文情况  65
  参与完成课题  65

高表达Mn-SOD肝细胞模型的构建及应用

内容摘要

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