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粘帚霉菌寄生核盘菌菌核相关酶类的活性分析及其cDNA消减文库的构建

作　者: 高会兰
导　师: 李世东
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理
关键词: 粘帚霉菌寄生几丁质酶葡聚糖酶 cDNA消减文库
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 115次
引　用: 3次
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内容摘要

粘帚霉(Gliocladium spp.)是一类重要的菌寄生菌,可寄生包括核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)在内的多种植物病原真菌,具有较大的生防潜力。本文对粘帚霉寄生核盘菌菌核的能力、其代谢产物的抑菌作用与细胞壁降解酶的关系、寄生后差异表达基因等方面进行了研究,为深入了解粘帚霉寄生核盘菌菌核的作用机理及其开发利用奠定基础。选取本实验室分离保存的17株粘帚霉接种到核盘菌菌核上,分析其寄生能力、代谢产物的抗菌活性、几丁质酶及葡聚糖酶活性。结果表明,HL-1-1、GZH-1-1及SYP-1-1寄生核盘菌菌核的能力最强,均达到四级水平;HL-1-1代谢产物对核盘菌菌丝的抑菌作用最强,且其葡聚糖酶活性最高;SHW-1-1代谢产物中几丁质酶活性最高。通过对供试17株粘帚霉的所测指标作统计分析表明,粘帚霉寄生核盘菌菌核的能力与其代谢产物的抑菌率及几丁质酶、葡聚糖酶的活性无显著相关性,其抑菌率与几丁质酶及葡聚糖酶的活性也无显著相关性。选取对核盘菌菌核寄生能力较强的粘帚霉HL-1-1,分析其对核盘菌菌核粉的降解程度与几丁质酶、葡聚糖酶活性的关系,结果表明,粘帚霉HL-1-1核盘菌菌核粉的降解程度与葡聚糖酶的活性高度相关,且达极显著水平,但与几丁质酶活性并无显著相关。因此,在粘帚霉菌株寄生核盘菌菌核过程中,几丁质酶与葡聚糖酶对于不同粘帚霉菌株寄生过程中发挥的作用不同,其他一些物质在寄生和对核盘菌菌丝生长的抑制作用中可能发挥着重要作用。为获得更多与粘帚霉寄生核盘菌菌核的相关基因,将粘帚霉HL-1-1寄生核盘菌菌核后的cDNA经RasΙ有效酶切后为Tester,纯培养的粘帚霉HL-1-1与核盘菌菌核的cDNA分别经RasΙ有效酶切后混合作为Driver,应用抑制消减杂交技术构建了粘帚霉HL-1-1 cDNA消减文库。通过PCR技术从文库中共筛选到1315个阳性克隆,克隆中插入片段大小主要集中于300~600bp之间。随机挑取120个克隆,经测序和同源性分析,获得60条有效序列,其中一些序列所编码的血红素加氧酶、核糖体蛋白L11、细胞色素P450及热激蛋白等都参与机体对胁迫条件的应答反应。11条序列在NCBI数据库中未找到显著匹配的序列,可能为新基因片断。分别将Tester和Driver进行标记作为探针,利用反向Northern杂交技术验证了所选取的25条序列全部为寄生后的差异表达基因片段。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-20
  1 核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de bary)及其生物防治研究进展  11
    1.1 核盘菌的寄主范围及危害  11
    1.2 核盘菌的生物防治  11
  2 菌寄生菌及其作用机制的研究进展  11-14
    2.1 菌寄生菌  11-12
    2.2 菌寄生菌作用机制的研究  12-14
  3 常用差异基因筛选方法  14-18
    3.1 表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）技术  14-15
    3.2 mRNA 差异显示（m RNA Differential Display，DD）技术  15-16
    3.3 代表性差异分析法（Representational difference analysis，RDA）  16
    3.4 DNA 微阵列技术（DNA microarray）  16-17
    3.5 抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）  17-18
  4 本研究的目的及意义  18-20
第二章粘帚霉菌寄生核盘菌菌核的能力及其代谢产物分析  20-30
  1 材料与方法  20-24
    1.1 材料  20-21
    1.2 方法  21-24
      1.2.1 菌核的制备  21
      1.2.2 菌株活化  21
      1.2.3 不同粘帚霉菌株对核盘菌菌核寄生能力的测定  21-22
      1.2.4 粘帚霉菌株寄生大豆核盘菌菌核代谢产物分析  22-23
      1.2.5 不同粘帚霉菌株对核盘菌菌核的寄生能力与细胞壁降解酶活性的相关性分析  23
      1.2.6 粘帚霉HL-1-1 对核盘菌菌核的降解能力与细胞壁降解酶活性的相关性分析  23-24
  2 结果与分析  24-28
    2.1 粘帚霉对核盘菌菌核寄生能力的比较与分析  24
    2.2 粘帚霉寄生大豆核盘菌菌核代谢产物分析  24-26
      2.2.1 代谢产物抑菌活性的测定  24-25
      2.2.2 代谢产物细胞壁降解酶的活性  25-26
    2.3 不同粘帚霉菌株寄生能力、代谢产物抑菌活性、代谢产物中几丁质酶及葡聚糖酶活性之间的相关分析  26-27
    2.4 培养时间对粘帚霉HL-1-1 代谢产物中细胞壁降解酶活性的影响  27-28
      2.4.1 葡聚糖酶和几丁质酶活性的检测  27-28
      2.4.2 粘帚霉HL-1-1 对核盘菌菌核的降解程度与细胞壁降解酶活性的相关性分析  28
  3 本章小结  28-30
第三章应用SSH 技术构建粘帚霉HL-1-1 寄生核盘菌菌核前后CDNA 消减文库  30-46
  1 材料与方法  30-42
    1.1 材料  30-31
    1.2 方法  31-42
      1.2.1 实验器皿处理  31-32
      1.2.2 菌株的培养  32
      1.2.3 总RNA 的提取  32
      1.2.4 总RNA 产量和质量的检测  32-33
      1.2.5 mRNA 纯化  33
      1.2.6 乙醇法浓缩mRNA  33
      1.2.7 应用SSH 技术分离差异表达基因片断  33-40
      1.2.8 差异表达序列片段的回收  40-41
      1.2.9 差异表达序列片段的克隆  41
      1.2.10 PCR 法鉴定重组质粒  41
      1.2.11 差异表达序列片段的测序及同源性分析  41-42
  2 结果与分析  42-46
    2.1 总RNA 及mRNA 的检测  42
    2.2 消化效率检测  42-43
    2.3 连接效率分析  43
    2.4 抑制性PCR 分析消减杂交效率  43-44
    2.5 PCR 法初步筛选重组质粒  44
    2.6 差异表达片断的序列测定及其同源性分析  44-46
第四章反式NORTHERN 杂交检测CDNA 消减文库有效性  46-50
  1 材料与方法  46-48
    1.1 材料  46-47
    1.2 方法  47-48
      1.2.1 探针的制备  47
      1.2.2 预杂交  47
      1.2.3 杂交  47-48
      1.2.4 洗膜  48
      1.2.5 免疫检测  48
  2 结果与分析  48-50
第五章讨论  50-52
  1 关于细胞壁降解酶类  50-51
  2 关于粘帚霉寄生核盘菌菌核CDNA 消减文库  51-52
结论  52-53
参考文献  53-60
附录  60-64
致谢  64-65
作者简历  65

粘帚霉菌寄生核盘菌菌核相关酶类的活性分析及其cDNA消减文库的构建

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