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cDNA芯片技术检测猪呼吸道疾病综合征相关病毒方法的建立

作　者: 陈微晶
导　师: 崔玉东；李曦
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪呼吸道病综合征 DNA芯片猪伪狂犬病毒猪细小病毒 Ⅱ型猪圆环病毒猪瘟病毒猪生殖和呼吸系统综合征病毒
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

猪呼吸道病综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)是近几年出现的、对养猪业危害性很大的一类以生长速度降低、饲料利用率降低、食欲减退、咳嗽、呼吸困难为特征的疾病。主要的相关病毒有猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus, PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、Ⅱ型猪圆环病毒(Porcine circoviruses, PCV2)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪生殖和呼吸系统综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。目前,对于这5种病毒的检测方法有ELISA方法、PCR方法、免疫荧光法、原位杂交(ISH)法等,虽然这些方法已经在检测方面发挥了很大的作用,但是,仍然存在一些弊端,如:不能实现大规模、高通量、快速检测等。基因芯片技术是90年代发展起来的一项新技术,它采用了并行处理和高度集成技术,可高效和高通量地进行核酸研究,并具有高效、灵敏以及操作相对简单等特点。因此,基因芯片技术在各个领域得以广范的重视和应用。本实验选取PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV5种病毒核酸的保守区域,设计5对特异性引物,以5种细胞培养毒的cDNA、DNA作为模板,进行PCR扩增,将5种病毒扩增产物与T载体连接,作为标准品,再经PCR扩增之后,作为探针,以0.4μg/μL的浓度点制于氨基修饰的玻片上;另以5种细胞培养毒的cDNA、DNA作为模板,进行不对称PCR扩增,所得产物制备成靶物,经CY3标记、纯化后,分别与cDNA芯片探针进行杂交,杂交后洗涤;杂交结果经Genepix4000A扫描仪扫描。实验结果,用5对特异性引物对这5种病毒核酸进行扩增,所扩增的产物作为靶物均可以特异地与制备好的cDNA芯片探针结合,荧光信号清晰可见,即试验中设计的5种芯片探针可以特异地检测这5种病毒;检测敏感性比普通PCR高102倍,即cDNA芯片检测5种病毒具有很高的敏感性;批内、批间试验证实应用cDNA芯片检测这5种病毒具有较好的稳定性。本实验表明,应用cDNA芯片技术检测这5种病毒具有特异性强、敏感性高、稳定性好等特点,为病毒检测方面提供一个新的、可靠性方法。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
第一章前言  6-14
  1.1 基因芯片技术的发展历程  6
  1.2 基因芯片技术的原理  6-7
  1.3 基因芯片的主要技术流程  7-8
  1.4 基因芯片在病毒检测中的应用  8-10
  1.5 猪呼吸道综合征病原简介  10-13
  1.6 本研究的目的和意义  13-14
第二章应用cDNA 芯片检测猪呼吸道疾病综合征相关病原方法的建立  14-24
  2.1 实验材料  14-15
  2.2 实验方法  15-24
第三章结果与分析  24-33
  3.1 5 种病毒质粒的制备  24-26
  3.2 cDNA 芯片的制备  26-28
  3.3 cDNA 芯片检测5 种病毒的敏感性试验  28-29
  3.4 cDNA 芯片检测5 种病毒的特异性试验  29-30
  3.5 cDNA 芯片检测5 种病毒的重复性试验  30
  3.6 应用cDNA 芯片方法对5 种病毒样品检测  30-33
第四章讨论  33-36
  4.1 芯片种类的选择  33
  4.2 检测引物设计  33
  4.3 影响cDNA 芯片检测方法的因素  33-34
  4.4 存在的问题  34-36
第五章结论  36-37
参考文献  37-43
致谢  43-44
个人简历  44

cDNA芯片技术检测猪呼吸道疾病综合征相关病毒方法的建立

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