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CARD结构域对猪BCL 10表达及细胞周期的影响

作　者: 薄联锋
导　师: 张德礼
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: NF-κB通路 BCL 10基因核内表达 TSS位点 CARD结构域
分类号: Q343
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在细胞的信号转导过程中,NF-κB通路可以激活或者抑制核内基因的表达,从而将外界的刺激转化成细胞的信号。在免疫系统中,NF-κB在控制抗原受体信号转导通路、调控诱导核转录因子中同样起关键作用。BCL 10是参与NF-κB通路的一个重要功能基因。BCL 10正常的表达水平可以促进免疫因子的产生,增强机体的天然免疫和抵御感染的能力。反之,BCL 10的异常表达,比如过表达、过度磷酸化和核内表达会导致一系列细胞因子的非正常表达,从而影响正常细胞的生理功能,甚至会导致淋巴瘤等多种疾病的发生。已知BCL10的CARD结构域、磷酸化位点以及C末端序列参与几乎全部蛋白功能的发挥。参考以上的研究结果,我们开展猪BCL 10的研究工作。实验室前期工作:通过电子克隆得到猪BCL 10的全长基因,通过特异性引物在猪脾脏克隆到该基因片段,并得到该基因原核表达蛋白,掌握了其原核表达特点。同时,检测结果显示,猪BCL 10基因mRNA在脾脏中表达最高,胸腺、大脑和下颌淋巴结表达次之,肝脏只有微量表达,肾脏没有表达,初步获得该基因在猪体内的表达情况。本研究进一步探讨猪BCL 10的CARD结构域相关功能,通过该基因序列分析和真核表达观测,取得以下结果:1.根据猪BCL 10基因的特点,通过激酶的作用位点和空间结构的预测,找到了可能与其核内表达相关的位点,并成功构建出完整猪BCL 10基因的真核表达载体pEGFP-B。同时,通过大引物扩增法构建出真核表达载体pEGFP-D(缺失CARD结构域的猪BCL 10基因)和pEGFP-P(缺失Thr-Ser-Ser位点的猪BCL 10基因)。2.转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC)后,Western Blot检测表明融合蛋白得到表达。分析发现,TSS位点(Thr-Ser-Ser)参与猪BCL 10的CARD结构域与其它蛋白的相互作用,是该基因的重要位点。同时,TSS位点的缺失会导致BCL 10出现核内表达。这些结果证实,TSS在猪BCL 10基因中具有重要作用。3.细胞周期变化测定表明,猪BCL 10的CARD结构域会引起细胞的G 1期缩短,S期和G 2/M期延长,表明该结构域在细胞生长过程中影响DNA的复制以及细胞有丝分裂,过度表达会导致细胞在有丝分裂前期停滞积累,但不会导致细胞凋亡。从而为进一步研究猪BCL 10蛋白在信号转导中的作用特点,以及淋巴瘤等疾病的诊断与治疗奠定基础。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
文献综述  11-20
  第一章 BCL 10 的研究进展  11-20
    1.1 BCL 10 蛋白结构与功能特点  11-12
    1.2 BCL 10 与 NF-κB 信号通路  12-16
      1.2.1 NF-κB 相关蛋白分子  12-13
      1.2.2 NF-κB 信号通路  13-15
      1.2.3 BCL10 参与NF-κB 通路  15-16
    1.3 BCL10 与细胞凋亡  16-17
      1.3.1 细胞凋亡  16
      1.3.2 蛋白的磷酸化  16-17
      1.3.3 BCL 10 的磷酸化参与细胞凋亡  17
    1.4 BCL10 与粘膜相关组织淋巴瘤  17-20
试验研究  20-38
  第二章 CARD 结构域对猪BCL 10 表达及细胞周期的影响  20-38
    2.1 材料  20
      2.1.1 菌株、细胞和质粒  20
      2.1.2 主要试剂  20
    2.2 方法  20-29
      2.2.1 猪BCL 10 CARD 结构域相关三个真核表达载体的构建  21-26
      2.2.2 猪BCL 10 CARD 结构域相关三个真核表达载体在猪血管内皮细胞中表达  26-29
    2.3 结果与分析  29-36
      2.3.1 PCR 结果  29-31
      2.3.2 猪BCL 10 CARD 结构域相关三个克隆载体构建结果  31
      2.3.3 猪BCL 10 CARD 结构域相关三个真核表达载体构建结果  31
      2.3.4 猪BCL 10 CARD 结构域相关三个载体序列分析  31-34
      2.3.5 正常细胞与转染空载体的细胞对照  34
      2.3.6 猪BCL 10 CARD 结构域相关三个真核表达载体转染SUVEC  34-35
      2.3.7 猪BCL 10 CARD 结构域相关真核载体表达融合蛋白Western blot 鉴定  35
      2.3.8 猪BCL 10 CARD 结构域相关真核载体表达对SUVEC 细胞周期的影响  35-36
    2.4 讨论  36-37
    2.5 小结  37-38
结论  38-39
参考文献  39-45
缩略词  45-46
附录  46-49
致谢  49-50
个人简介  50

CARD结构域对猪BCL 10表达及细胞周期的影响

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