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小鼠FOXL2基因和Par-4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

作　者: 沈涛
导　师: 李青旺
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物学
关键词: FOXL2基因 Par-4基因 同源重组 腺病毒载体
分类号: Q95-33
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


叉头框L2（Forkhead Box L2,FOXL2）基因是在动物眼睑以及卵巢颗粒细胞中有表达的基因。该基因所编码的蛋白在动物胚胎发育以及卵巢的形态及功能的维持中起着重要的作用。FOXL2基因发生突变,则会导致动物患有小睑裂综合症（BPES）,并经常伴随有卵巢早衰等症状。FOXL2基因在动物性别控制中也起着关键作用。缺失FOXL2基因的雌性动物,其卵巢细胞会向睾丸支持细胞和间质细胞方向分化。前列腺凋亡反应因子4（prostate apoptosis response-4,Par-4）是一种在动物睾丸细胞中表达的基因。该基因所编码的蛋白具有诱导癌细胞凋亡的作用。应用Par-4蛋白在癌症治疗中有着广阔的前景。然而由于天然的Par-4蛋白非常稀少,不足以满足科学研究以及临床上的应用。因此利用转基因技术生产Par-4蛋白逐渐成为热点。本研究首先从小鼠卵巢组织中提取总RNA,再通过反转录和PCR技术获得FOXL2基因cDNA全长序列;同时也从小鼠睾丸组织中提取总RNA,再通过反转录和PCR技术获得了Par-4基因的cDNA全长序列。然后将两个基因分别进行重组腺病毒载体的构建及鉴定。获得试验结果如下:（1）用一对预先设计好的引物,采用反转录和RCP法,从小鼠卵巢细胞中扩增出FOXL2基因cDNA全长序列,经琼脂糖凝胶电泳后,结果显示在1250bp处有有一条阳性目的条带。并对所得cDNA进行测序,得到结果与GeneBank中记载的相一致。（2）用细菌内同源重组法构建FOXL2基因重组腺病毒载体。将穿梭载体pShuttle-FOXL2-IRES-GFP经酶切鉴定后,与pAdEasy-1质粒共同转染BJ5183大肠杆菌进行同源重组,获得重组pAd-FOXL2-GFP质粒。将pAd-FOXL2-GFP质粒经PacⅠ酶切线性化后,经琼脂糖凝胶电泳获得一个4.5kb大小的特异性片段表明同源重组成功。并通过设计引物对Ad-FOXL2-GFP载体进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳,得到一个1250bp大小的片段,证明已经将FOXL2基因构建进腺病毒载体。再用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,观察到GFP的表达,并且测得腺病毒滴度为:TCID50=10-8.61/0.1 ml。（3）用一对预先设计好的引物,采用反转录和RCP法,从小鼠卵巢细胞中扩增出Par-4基因cDNA全长序列,经琼脂糖凝胶电泳后,结果显示在1050bp处有有一条阳性目的条带。并对所得cDNA进行测序,得到结果与GeneBank中记载的相一致。（4）用细菌内同源重组法构建Par-4基因重组腺病毒载体。将穿梭载体pShuttle-Par4-IRES-GFP经酶切鉴定后,与pAdEasy-1质粒共同转染BJ5183大肠杆菌进行同源重组,获得重组pAd-Par4-GFP质粒。将pAd-Par4-GFP质粒经PacⅠ酶切线性化后,经琼脂糖凝胶电泳获得一个4.5kb大小的特异性片段表明同源重组成功。并通过设计引物对Ad-Par4-GFP载体进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳,得到一个1050bp大小的片段,证明已经将Par4基因构建进腺病毒载体。再用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,观察到GFP的表达,并且测得腺病毒滴度为:TCID50=10-8.72/0.1 ml。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章 FOXL2 基因的研究现状  12-14
  1.1 FOX 基因家族概况  12
  1.2 FOXL2 基因概况  12
  1.3 FOXL2 基因功能  12-14
    1.3.1 参与眼睑的形成  12-13
    1.3.2 参与卵巢的形成与维持卵巢正常功能  13
    1.3.3 性别控制  13
    1.3.4 FOXL2 基因研究进展  13-14
第二章 Par-4 基因的研究现状  14-17
  2.1 Par-4 基因概况  14
  2.2 Par-4 基因结构及功能  14-17
    2.2.1 Par-4 基因的结构  14
    2.2.2 Par-4 基因的功能  14-17
第三章 腺病毒载体的研究现状  17-22
  3.1 腺病毒生物学特性  17
  3.2 腺病毒的感染周期  17-18
  3.3 腺病毒载体的研究进展  18
  3.4 腺病毒载体构建的方法  18-20
    3.4.1 腺病毒载体体外连接法  19
    3.4.2 腺病毒载体细胞内同源重组法  19
    3.4.3 腺病毒载体细菌内同源重组法  19
    3.4.4 其他构建腺病毒载体的方法  19-20
  3.5 腺病毒载体的优点  20
  3.6 腺病毒载体的应用  20-22
    3.6.1 治疗癌症  20
    3.6.2 遗传疾病的治疗  20-21
    3.6.3 载体疫苗的应用  21-22
第四章 FOXL2 基因cDNA 的克隆  22-29
  4.1 材料与方法  22-25
    4.1.1 试验材料  22-23
    4.1.2 试验方法  23-25
  4.2 结果与分析  25-27
    4.2.1 小鼠卵巢总RNA 的提取  25
    4.2.2 FOXL2 基因的cDNA 合成和序列测定  25-27
  4.3 讨论  27-28
  4.4 小结  28-29
第五章 FOXL2 基因重组腺病毒载体的构建  29-39
  5.1 材料与方法  29-35
    5.1.1 试验材料  29-30
    5.1.2 试验方法  30-35
  5.2 结果与分析  35-37
    5.2.1 FOXL2 基因重组腺病毒载体的酶切与PCR 鉴定  35-36
    5.2.2 FOXL2 基因重组腺病毒载体在HEK293 细胞中的表达  36
    5.2.3 FOXL2 基因重组腺病毒载体病毒滴度计算  36-37
  5.3 讨论  37-38
  5.4 小结  38-39
第六章 Par-4 基因cDNA 的克隆  39-45
  6.1 材料与方法  39-41
    6.1.1 试验材料  39-40
    6.1.2 试验方法  40-41
  6.2 结果与分析  41-43
    6.2.1 小鼠睾丸总RNA 的提取  41-42
    6.2.2 Par-4 基因的cDNA 扩增与测序  42-43
  6.3 讨论  43-44
  6.4 小结  44-45
第七章 Par-4 基因重组腺病毒载体的构建  45-54
  7.1 材料与方法  45-50
    7.1.1 试验材料  45-46
    7.1.2 试验方法  46-50
  7.2 结果与分析  50-52
    7.2.1 Par-4 基因重组腺病毒载体酶切与PCR 鉴定  50-51
    7.2.2 Par-4 基因重组腺病毒载体在HEK293 细胞中的表达  51-52
    7.2.3 Par-4 基因重组腺病毒载体病毒滴度的计算  52
  7.3 讨论  52-53
  7.4 小结  53-54
结论与创新点  54-55
  结论  54
  创新点  54-55
参考文献  55-61
附录一  61-62
附录二  62-63
缩略词和中英文对照表  63-64
致谢  64-65
作者简介  65

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中图分类: > 生物科学 > 动物学 > 动物学的研究与实验 > 动物学实验（实验动物学）、动物学技术
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