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链状亚历山大藻生长衰亡相关基因的筛选及分析

作　者: 仲洁
导　师: 隋正红
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 赤潮链状亚历山大藻衰亡抑制性消减杂交 actin cob 进化
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着工业的发展,赤潮爆发的频率和规模越来越大,给人们带来的危害也越来越大,因此很多研究者都把目光转向了赤潮的研究当中,尤其是对赤潮爆发的研究,而关于赤潮衰亡的报道却相对较少,关于赤潮衰亡的分子机制的研究就更少了。本文采用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建了衰亡期的链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)特异表达的cDNA文库。共获得单克隆800个,利用巢式引物进行PCR筛选,最终确定有556个阳性克隆。利用斑点杂交技术对这些阳性克隆进行差异筛选,获得160个差异表达克隆。测序后得到片段125个,经过归类,获得21种序列,其中6种在NCBI中经Blast,能够与已知基因匹配,这些基因分别是CHK1类似检测点蛋白(checkpoint-like protein)、核酸外切酶复合体、谷氧还蛋白、Na~+/ K~+ ATPase、叶绿体中的一个开放阅读框和pG1蛋白,其他blast无同源序列,可能为新基因。推测链状亚历山大藻的衰亡过程涉及到一些DNA损伤、mRNA降解过程、氧化还原状态的变化、离子动态平衡的变化以及叶绿体一些生理状况的变化等过程。我们用荧光定量PCR技术对这6个片段当中出现频率最高的pG1蛋白进行了研究,研究结果表明,在无N、无P和正常培养条件下衰亡期的藻中,该基因的表达量均高于在其他时期的表达,证明该基因是链状亚历山大藻衰亡相关的基因。从有毒赤潮藻种链状亚历山大藻中成功克隆actin基因的部分序列,经测序该片段长度为110bp。为了研究保守基因的进化地位,对本次克隆得到的actin基因片段和本实验室以前克隆得到的cob基因片段进行了同源序列比对,并以它们为基础分别构建了系统进化树。结果显示以这两种基因构建的系统进化树是不同的,揭示这两种基因的系统进化地位可能存在差异。用actin构建的系统进化树与物种的分类地位基本一致,而用cob构建的系统进化树则与物种分类地位存在差异。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-28
  1 赤潮  12-18
    1.1 赤潮及危害  12-13
    1.2 赤潮与甲藻  13-15
    1.3 赤潮爆发及衰亡的研究  15-18
  2 赤潮的分子生物学研究  18-20
    2.1 赤潮生物过程调控基因的分离与分析  18-19
    2.2 赤潮的核酸检测技术  19-20
  3 差异基因的筛选方法  20-26
    3.1 消减杂交法  20
    3.2 mRNA 差异显示技术(DDRT‐PCR)  20-21
    3.3 代表性序列差异分析  21-22
    3.4 cDNA‐AFLP 技术  22
    3.5 基因芯片技术  22-23
    3.6 抑制性消减杂交技术  23-26
  4 课题的目的和意义  26-28
第二章链状亚历山大藻生长衰亡相关基因的筛选与分析  28-61
  1 前言  28
  2 材料与方法  28-50
    2.1 藻种与菌种  28
    2.2 培养基  28-29
    2.3 其他试剂  29-30
    2.4 常用耗材与仪器  30-31
    2.5 链状亚历山大藻的培养及收集  31
    2.6 链状亚历山大藻总 RNA 的制备  31-32
    2.7 链状亚历山大藻 cDNA 的制备及抑制性消减杂交  32-41
    2.8 杂交文库的构建  41-42
    2.9 斑点杂交筛选差异克隆  42-45
    2.10 差异克隆测序及同源性分析  45-46
    2.11 荧光定量验证  46-50
  3 实验结果  50-59
    3.1 Alexandriumcatenella 生长曲线  50
    3.2 总 RNA 质量检测  50-51
    3.3 接头连接效率检测  51
    3.4 消减产物的巢式 PCR 分析  51-52
    3.5 菌落 PCR 检测  52-53
    3.6 斑点杂交结果分析  53-55
    3.7 序列分析  55-57
    3.8 荧光定量结果分析  57-59
  4 讨论  59-61
第三章链状亚历山大藻中 actin 和 cob 基因部分序列的克隆与分析  61-74
  1 前言  61-62
  2 材料与方法  62-65
    2.1 实验材料  62
    2.2 藻的培养  62
    2.3 总 RNA 的提取  62
    2.4 cDNA 的合成  62
    2.5 引物设计及 PCR 扩增  62
    2.6 凝胶回收 actin 基因片段  62-63
    2.7 actin 基因克隆的制备  63-64
    2.8 测序及序列分析  64-65
  3 实验结果  65-72
    3.1 PCR 扩增结果  65-66
    3.2 测序结果、遗传距离分析及系统进化树的构建  66-72
  4 讨论  72-74
参考文献  74-80
致谢  80-81
个人简历  81
发表的学术论文  81

链状亚历山大藻生长衰亡相关基因的筛选及分析

内容摘要

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