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以融合蛋白PhaP-RGD和PhaP-IKVAV修饰的PHA膜作为培养神经干细胞基底材料的功能评价

作　者: 谢宏林
导　师: 陈致铠
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 聚羟基脂肪酸酯活性短肽神经干细胞组织工程神经修复
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

基于神经干细胞(NSCs)的治疗方法在神经修复方面已经显示了巨大的潜力,然而,由于环绕着神经干细胞周围的生物化学和机械因素都会影响NSCs的生长行为,所以严密控制NSCs的生长行为是富有挑战性的。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种已经被证明了具有许多优秀性质的组织工程生物材料,这种材料还可以被生物活性分子修饰而具备生物活性,从而促进细胞间和细胞与基质间的联系。在此我们将一种大部分细胞外基质蛋白都含有的RGD序列和层粘连蛋白来源的IKVAV序列分别和一种PHA紧密结合蛋白PhaP融合表达。用这两种融合蛋白分别修饰:聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx),聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸-3羟基戊酸酯(PHBVHHx)和多聚乳酸(PLA)材料的膜,以此作为基底材料来培养NSCs并研究膜材料对其增殖和分化行为。实验结果表明,PhaP-IKVAV修饰的PHBVHHx膜比其他经过同样融合蛋白修饰的PHBHHx、PLA和所有未经修饰的膜更加能够促进NSCs的增殖活性。而PhaP-IKVAV修饰过的PHBHHx、PHBVHHx和PLA都能促进由NSCs分化而来的β-tublinⅢ-阳性神经细胞突出的生长。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
英文缩略词表  5-8
第一章前言  8-19
  1.1 神经干细胞  8-10
  1.2 NSCs与神经修复  10-11
  1.3 组织工程概述  11-12
  1.4 PHA材料和神经组织工程  12-15
  1.5 PHA紧密结合蛋白PhaP  15-16
  1.6 生物活性短肽RGD、IKVAV与神经细胞和NSCs的关系  16-18
  1.7 实验目的和意义  18-19
第二章材料与方法  19-33
  2.1 实验动物  19
  2.2 基本试剂和材料  19-20
  2.3 主要溶液以及试剂盒  20-22
  2.4 仪器与设备  22-23
  2.5 实验方法  23-33
    2.5.1 动物饲养  23
    2.5.2 PHA和PLA材料的成膜  23
    2.5.3 蛋白表达载体的构建  23-28
    2.5.4 蛋白的诱导表达表达，纯化与透析  28-30
    2.5.5 蛋白的电泳验证和蛋白的活性检测  30-31
    2.5.6 SD大鼠孕鼠的解剖& NSCs的分离、培养与传代  31-32
    2.5.7 膜的处理与细胞接种  32
    2.5.8 SEM电镜扫描检测膜表面形态  32
    2.5.9 CCK-8 检测  32-33
    2.5.10 细胞免疫染色检测  33
第三章结果与分析  33-46
  3.1 材料的电镜观察  34-35
  3.2 PhaP-IKVAV质粒的构建  35-37
    3.2.1 带有PhaP的原始表达质粒的获得  35
    3.2.2 带有PhaP-IKVAV的表达质粒的扩增  35-37
  3.3 蛋白的诱导表达与纯化  37-39
    3.3.1 PhaP和PhaP-RGD的纯化  37
    3.3.2 PhaP-IKVAV的纯化  37
    3.3.3 PhaP-RGD和PhaP-IKVAV融合蛋白的活性检测  37-39
  3.4 NSCs的悬浮培养与鉴定  39
    3.4.1 NSCs的悬浮培养  39
    3.4.2 NSCs的免疫细胞化学鉴定  39
  3.5 NSCs在各种经蛋白修饰的膜上的CCK-8 检测  39-42
  3.6 经蛋白修饰的PHA和PLA膜对NSCs分化的影响  42-46
第四章讨论  46-49
第五章结论  49-50
参考文献  50-59
致谢  59-60
发表论文情况  60-61
个人简历  61

以融合蛋白PhaP-RGD和PhaP-IKVAV修饰的PHA膜作为培养神经干细胞基底材料的功能评价

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