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乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,每年新发乳腺癌病例120万,50万妇女死于乳腺癌。膳食因素对于乳腺癌的发生发展具有重要影响,通过膳食途径防治乳腺癌已成为乳腺癌综合防治的重要策略之一。大量流行病学研究结果表明,乳腺癌的发病率与大豆摄入量呈负相关。大豆及其制品富含染料木黄酮(Genistein,GEN)、黄豆苷元(daidzein)和大豆黄素(glycetin)等异黄酮(isoflavones)成分,GEN作为大豆中的主要异黄酮成分,其分子结构特征与机体内源性雌激素相似,具有模拟或拮抗雌激素的双重调节活性,同时还是蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性抑制剂,大量体内外实验证实GEN具有抑制乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡、抑制乳腺癌血管生成等抗乳腺癌作用,从而被认为是大豆抗癌的主要活性成分。虽然GEN抗乳腺癌作用的研究已有大量报道,但其抗癌作用的分子机制尚未完全阐明。端粒(Telomere)是真核生物细胞线性染色体末端的一种特殊结构,随着细胞有丝分裂次数的增加而不断缩短,当其缩短至某一临界值时,最终引起细胞衰老死亡。端粒酶(Telomerase)是一种特殊的核糖核蛋白复合体,其主要功能是维持端粒的长度。在正常体细胞中端粒酶活性不表达或是低表达,但在生殖细胞、干细胞中高表达,在肿瘤细胞中端粒酶活性检出率更是高达85%以上,大量研究资料表明端粒酶的激活是影响肿瘤发生发展的重要环节。人端粒酶包括3个主要组成部份,即人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR),端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein 1,TP1),端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT),hTERT又称为端粒酶催化亚单位(hEST2 )。在端粒酶激活过程中,hTERT起着限速作用,是恶性肿瘤发生发展的重要影响因素。hTERT的表达水平和翻译后调节(磷酸化修饰、核转位)对于端粒酶活性调节有重要影响。临床研究资料表明乳腺癌中端粒酶阳性率在90%以上,目前国内外已有大量以端粒酶作为乳腺癌治疗靶点的研究报道。GEN抗乳腺癌作用与端粒酶活性调节之间的关系研究报道较少,本研究以雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达阳性(ER+)的MCF-7和ER表达阴性(ER-)的MDA-MB-231两种人乳腺癌细胞株为对象,首先通过MTT实验、TRAP-ELISA分别观察不同剂量的GEN在雌激素E2存在或缺失情况下对两种乳腺癌细胞生长和端粒酶活性的影响,初步明确GEN和E2对乳腺癌细胞端粒酶的调节作用及其与乳腺癌细胞增殖的关系;然后再通过RT-PCR、western-blot、免疫细胞化学等方法,研究GEN对乳腺癌细胞hTERT mRNA和hTERT、p-Akt蛋白表达,以及核因子NF-κB p65和热休克蛋白90(HSP90)核转位的影响,以期探讨GEN和E2调节乳腺癌细胞端粒酶活性的可能分子机制。主要实验结果和结论如下:1.对于雌激素依赖性的乳腺癌MCF-7细胞, 10-9 mol/L的雌激素E2明显促进其增殖,并明显增强端粒酶活性,低浓度(5×10-6 mol/L)的GEN单独作用时与E2的作用类似,高浓度(40,80×10-6 mol/L)的GEN单独作用时呈剂量依赖性明显抑制端粒酶活性和细胞增殖,低浓度的GEN与E2联合作用时,端粒酶活性和细胞增殖较对照组无明显变化(p >0.05),而高浓度的GEN与E2联合作用时,端粒酶活性和细胞增殖均明显降低(p <0.01)。对于雌激素非依赖性的乳腺癌MDA-MB-231细胞,雌激素E2对端粒酶活性和细胞增殖均无明显影响(p >0.05),而不同浓度的GEN无论是在雌激素E2存在还是缺失的情况下,均明显抑制端粒酶活性和细胞增殖,且抑制效应与GEN呈浓度依赖性。以上结果表明,雌激素E2仅对雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性和细胞增殖产生明显影响,而GEN对雌激素依赖性和非依赖性的乳腺癌细胞端粒酶活性和细胞增殖的都会产生影响,E2和GEN对乳腺癌端粒酶活性的影响与增殖能力的变化趋势一致,提示二者可能通过调节乳腺癌细胞端粒酶活性,进而影响细胞增殖能力的变化。2.对于ER+乳腺癌MCF-7细胞,10-9 mol/L的雌激素E2明显促进hTERT mRNA和蛋白表达,低浓度(5×10-6 mol/L)的GEN单独作用时与E2的作用类似,高浓度(40×10-6 mol/L)的GEN单独作用时明显抑制hTERT mRNA和蛋白表达,低浓度的GEN与E2联合作用时,hTERT mRNA和蛋白表达水平与对照组无明显差异,而高浓度的GEN与E2联合作用时,hTERT mRNA和蛋白表达水平明显降低。对于ER-乳腺癌MDA-MB-231细胞,雌激素E2对hTERT mRNA和蛋白表达无明显影响(p >0.05),而不同浓度的GEN无论是在雌激素E2存在还是缺失的情况下,均明显降低hTERT mRNA和蛋白表达水平。以上结果表明,雌激素E2和GEN可通过调节乳腺癌hTERT表达水平,进而影响端粒酶活性的变化。3.对于ER+乳腺癌MCF-7细胞,雌激素E2明显促进p-Akt蛋白表达,免疫细胞化学染色显示NF-κB p65和HSP90核转位增加,低浓度(5×10-6 mol/L)的GEN单独作用时与E2的作用类似,高浓度(40×10-6 mol/L)的GEN单独作用时明显降低p-Akt蛋白表达,抑制NF-κB p65和HSP90核转位,低浓度的GEN与E2联合作用时,p-Akt蛋白表达水平以及NF-κB p65、HSP90核转位与对照组无明显差异,而高浓度的GEN与E2联合作用时,p-Akt蛋白表达水平以及NF-κB p65、HSP90核转位明显降低。对于ER-乳腺癌MDA-MB-231细胞,雌激素E2对p-Akt蛋白表达和NF-κB p65、HSP90核转位无明显影响,而不同浓度的GEN无论是在雌激素E2存在还是缺失的情况下,均明显降低p-Akt蛋白表达和NF-κB p65、HSP90核转位。以上结果表明,雌激素E2和GEN可通过调节磷酸化修饰hTERT的p-Akt蛋白表达水平,以及介导hTERT发生核转位的分子伴侣NF-κB p65和HSP90核转位情况,进而影响端粒酶的活性。综上所述,雌激素E2和GEN均可通过调节hTERT表达水平,以及磷酸化修饰和核转位影响乳腺癌细胞端粒酶活性,进而影响乳腺癌细胞增殖。GEN对乳腺癌细胞端粒酶活性和细胞增殖的影响与其作用剂量、乳腺癌细胞的ER表达状态以及E2存在与否密切相关。对于雌激素依赖性的乳腺癌细胞,低浓度的GEN在雌激素缺失情况下通过ER途径发挥拟雌激素作用,但在雌激素存在情况下则可拮抗雌激素的作用,高浓度的GEN在雌激素存在或缺失的情况下均降低端粒酶活性,并抑制乳腺癌细胞增殖。对于雌激素非依赖性的乳腺癌细胞,不同剂量的GEN在雌激素存在或缺失的情况下均可降低端粒酶活性,并抑制细胞增殖。以上结果提示,由于生理浓度的GEN在雌激素缺失情况下可以模拟内源性雌激素作用,增强端粒酶活性,促进乳腺癌细胞增殖,因此绝经期后的ER+乳腺癌患者由于缺乏内源性雌激素,在应用GEN时可能会带来促进肿瘤生长的副作用,而其他乳腺癌患者应用GEN可能会带来有益的治疗作用。
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