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表皮调节素、纤联蛋白与去唾液酸糖蛋白受体介导HBV进入肝细胞机理初步研究

作　者: 王峰
导　师: 王国栋；王升启
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物物理学
关键词: 表皮调节素纤联蛋白去唾液酸糖蛋白受体蛋白相互作用乙型肝炎病毒
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是世界范围的严重公共卫生问题之一,但是目前没有特效防治方法,存在的关键问题在于HBV基因组较小,易发生突变,限制了靶向抗病毒药物的发展。最近的研究表明,抑制宿主细胞中某些蛋白的功能可以阻断病毒感染。与病毒基因组相比,人类基因组序列中可能包括更多与病毒复制有关的基因。应用DNA微阵列(芯片)技术系统分析宿主基因表达,是一种从宿主细胞中发现潜在抗病毒靶标的有效方法。本室通过应用基因芯片技术,获得了HBV感染相关的3个关键分子,即表皮调节素(Epiregulin,简称EREG)、纤联蛋白(Fibronectin,简称FN)和去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein recertor,简称ASGPR)。本实验旨在前期工作的基础上,研究上述3个关键分子与乙型肝炎病毒表面抗原(surface HBV antigens,HBsAg)的相互作用及其在HBV感染肝细胞中的作用,以解释HBV吸附并进入细胞的机理,为基于病毒与宿主相互作用的新型抗HBV药物的开发提供理论依据。研究获得了以下主要结果:1.首次发现EREG和HBsAg存在相互作用,通过构建EREG的真核表达载体并将其转染肝细胞发现,转染EREG有助于HBsAg对细胞的吸附,因此推测它可以充当胞外可溶性辅助受体,帮助HBV与肝细胞结合,从而有利于HBsAg和膜上受体相互作用以使病毒进入肝细胞。2.采用免疫共沉淀技术,对HBsAg、FN和ASGPR之间的相互作用进行了验证,并将FN和ASGPR分段克隆表达,通过GST-pull down技术筛选了FN、ASGPR与HBsAg相互作用的功能域片段。结果显示FN主要通过其中央细胞结合域的N端及Ⅱ型肝素结合域(HeparinⅡ)与HBsAg相互作用,通过120kD细胞结合域与ASGPR相互作用。ASGPR主要通过其糖蛋白识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)与FN的相互作用。但采用GST-pull down技术未能筛出ASGPR与HBsAg的互作区域,可能是原核表达的ASGPR功能域片段缺少修饰或实验中所用的相互作用条件不合适。综上所述,本研究证实了EREG、FN、ASGPR和HBsAg之间的相互作用,筛选了FN、ASGPR和HBsAg相互作用的功能域,并研究了EREG和HBsAg之间的相互作用及其与HBV进入肝细胞的关系,发现EREG在HBV和肝细胞结合的过程中起着胞外辅助性受体的作用。感染

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-9
第一章文献综述  9-17
  1.1 HBV 基因组及编码蛋白  9-10
  1.2 HBV 感染致病关键分子及潜在宿主靶点研究进展  10-15
    1.2.1 当前抗HBV 药物研究现状及宿主靶标学术思想的提出  10-12
    1.2.2 HBV 受体研究进展  12-13
    1.2.3 乙肝病毒研究中尚未解决的关键问题  13-14
    1.2.4 EREG、FN和ASGPR的研究概况  14-15
  1.3 本研究的目的意义及方法  15-17
第二章实验材料、仪器  17-22
  2.1 主要试剂及来源  17-18
  2.2 主要仪器与设备  18
  2.3 菌种和质粒  18
  2.4 细胞株和细胞培养  18
  2.5 主要溶液及配制  18-20
  2.6 引物  20-22
第三章 EREG与HBV进入肝细胞关系研究  22-32
  3.1 方法  22-25
  3.2 结果与分析  25-30
    3.2.1 EREG 抗体对HepG2.2.15 细胞培养液中HBsAg、HBeAg 的抑制分析  25-26
    3.2.2 EREG 抗体对HepG2.2.15细胞增殖的影响  26
    3.2.3 HepG2 细胞转染EREG 后 HBsAg 对HepG2 细胞的吸附分析  26-27
    3.2.4 GST 沉降（pulldown）分析EREG 和HBsAg 的体外相互作用  27-28
    3.2.5 免疫共沉淀验证EREG 和HBsAg 之间的相互作用  28-29
    3.2.6 EREG 剂量依赖性的抑制HepG2.2.15 细胞增殖  29-30
  3.3 讨论  30
  3.4 本章小结  30-32
第四章 FN和ASGPR与HBV相互作用关系研究  32-43
  4.1 方法  32-34
  4.2 结果与分析  34-41
    4.2.1 免疫共沉淀证实HepG2.2.15 细胞中FN、ASGPR与HBsAg相互作用  34-36
    4.2.2 FN 各结构域片段的PCR 扩增  36
    4.2.3 FN 各重组质粒的构建及鉴定  36
    4.2.4 FN 各重组融合蛋白的可溶性表达  36-37
    4.2.5 FN 各表达产物的 Western 印迹分析及纯化  37-38
    4.2.6 蛋白芯片筛选 FN 与 HBsAg 相互作用的区域  38-39
    4.2.7 GST-pulldown 分析 FN 与 HBsAg、ASGPR 相互作用的区域  39
    4.2.8 ASGPR 与 FN、HBsAg 相互作用功能域研究  39-41
  4.3 讨论  41-42
  4.4 本章小结  42-43
全文总结  43-45
参考文献  45-49
缩略词  49-51
致谢  51-52
作者简介  52

表皮调节素、纤联蛋白与去唾液酸糖蛋白受体介导HBV进入肝细胞机理初步研究

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