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重组小鼠gAcrp30的基因克隆、表达及生物活性研究

作　者: 王乐媛
导　师: 王小宁
学　校: 中国人民解放军第一军医大学
专　业: 分子免疫学
关键词: gAcrp30 gene clone gene expression
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

脂肪细胞补体相关蛋白gAcrp30是已分化的脂肪细胞特异分泌的蛋白质因子，主要作用是促进脂肪细胞新成代谢，分子量25kDa，有文献报导，无论是从血浆中提取的，还是利用基因工程手段从大肠杆菌中表达制备的人不含信号肽的Acrp30——gAcrp30，均能显著地诱导小鼠肌体内游离脂肪酸在肌肉中氧化，并相应降低体重—从而表明gAcrp30是人们梦寐以求的一类激素之一，其作用机理是因为它能将信号从脂肪组织传导至肌肉。促使肌肉组织大量燃烧脂肪产生能量从而减少脂肪的储存。而传统的减肥的方法有两种：一、使肠壁的吸收减少，通过节食来完成，这样就会影响到肠壁正常物质的吸收；二、过加大运动量的方法，并在运动后少量进食，这对于一些患糖尿病和心脏病的病人无疑是不可行的，况且肥胖病人有大多数罹患这些疾病。如何解决这些问题，gAcrp30可为一种好的方法。本研究通过RT-PCR技术从小鼠脂肪细胞中克隆了不含信号肽序列的全长小鼠gAcrp30 cDNA，序列测定表明本研究已克隆的gAcrp30序列同国外报道的序列一致。将不含信号肽序列的小鼠Acrp30基因克隆至原核表达载体pET-21a中，构建成重组原核表达质粒pET-21a/gAcrp30。将该重组质粒导入宿主菌BL21，经IPTG诱导后获得高水平表达(目标蛋白表达＞20％)。经SDS-PACE分析表明：表达产物主要为不可溶性的蛋白质聚集体-包涵体。将已收集的菌体经超声破碎后，2mol/L尿素，1％吐温-80洗涤后，离心收集包涵体。该包涵体经8mol/L尿素溶解变性后，采用透析和稀释二种复性方法进行复性比较，复性样品经阴离子交换层析Q—Sepherose Fast Flow和Q-Sepherose high performance(h.p.)二步阴离子交换层析得到单一条带，分子量为25KDa。免疫印迹结果表明，通过表达和纯化所获得的蛋白为小鼠gAcrp30。上述研究结果将为进一步研究小鼠gAcrp30的理化性质及人gAcrp30的研究奠定基础。第一军医大学硕1..论文(王乐媛)小鼠gAc甲30的基因克隆、表达及生物活性研究肥胖症问题不仅在发达国家十分普遍，在发展中国家也是不可忽视的问题。亚洲人脂肪主要堆积在腹部。有肥胖症的人最容易患糖尿病、心脏病、高血压及中风疾病，防止和减少体重超重方法就是不要过量饮食，加强体育运动。中国在国民经济稳步增长的10年间从1990年到2000年，大中城市中身体超重和患肥胖症人数从9.7%增加到14.9%，乡村从6.8%增加到8.4%，gAcrp30的开发成功，对我国的肥胖症患者将是一个福音，从而间接的减少由肥胖而引发的搪尿病和高血压病，对提高整体的国民健康水平将具有十分重要的意义。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-10
前言  10-13
第一部分小鼠gAcrp30基因的克隆、序列测定及表达质粒的构建  13-27
  摘要  13
  一、材料与方法  13-22
    1 材料  13-14
    2 方法  14-22
  二、结果  22-25
    1 引物设计  22
    2 小鼠脂肪组织递RNA，mRNA分离  22-23
    3 RT-PCR  23
    4 小鼠gAcrp30 PCR产物的克隆及鉴定  23
    5 小鼠gAcrp30 PCR产物的序列测定  23-25
  三、讨论  25-27
第二部分重组小鼠gAcrp30蛋白在大肠杆菌表达和纯化研究  27-33
  摘要  27
  一、材料与方法  27-30
    1 材料  27
    2 方法  27-30
  二、结果  30-32
    1 原核表达载体的构建  30
    2 重组子表达产物的RT-PCR检测  30-31
    3 小鼠gAcrp30基因在大肠杆菌中表达产物的SDS PAGE  31-32
  三、讨论  32-33
第三部分重组小鼠gAcrp30蛋白在大肠杆菌表达和纯化研究  33-45
  摘要  33
  一、材料与方法  33-36
    1 材料  33-34
    2 方法  34-36
  二、结果  36-42
    1 gAcrp30表达和包涵体制备  36-37
    2 稀释复性  37
    3 透析复性  37-38
    4 复性产物的离子交换层析  38
    5 表达产物免疫学鉴定  38-39
    6 gAcrp30动物实验  39-42
  三、讨论  42-44
  四、展望  44-45
论文总结:  45-46
参考文献:  46-49
综述:  49-59
致谢:  59

重组小鼠gAcrp30的基因克隆、表达及生物活性研究

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