学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

卤虫（Artemia Shrimp）孵化酶的生物化学特性及孵化腺细胞的免疫细胞化学研究

作　者: 钟其旺
导　师: 樊廷俊
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 卤虫孵化酶丝氨酸蛋白酶金属蛋白酶孵化腺细胞免疫细胞化学
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 58次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

卤虫孵化酶（HE）是由卤虫早期胚胎特异性分泌的、在孵化过程中起关键作用的一种蛋白酶。我们利用67％硫酸铵沉淀、DEAE-sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephacryl凝胶过滤柱层析，并以酪蛋白为其蛋白酶水解活性的检测底物、以卵膜为其卵壳裂解活性的特异性底物，从卤虫胚胎孵化液中分离纯化出了卤虫的孵化酶分子，其在SDS-PAGE电泳中的分子量约为98.5kDa。对孵化酶纯化样品进行生化性质和酶性质分析发现，卤虫孵化酶的最适反应温度约为40℃，最适pH为8.5左右；该孵化酶对p-APMSF、SBTI极为敏感，对PMSF、LBTI和TLCK也非常敏感，但对chymostatin、Leupeptin、Pepstatin、Bestatin、TPCK、NEM和IAM不敏感，表明该酶极可能是一种属于胰蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶。利用EDTA和几种金属离子对该酶活性进行研究发现，该孵化酶可浓度依赖性地为EDTA所抑制，50mmol/L的EDTA对该酶活性的抑制作用可达约56.5％；此外，该酶对Zn²⁺非常敏感，2.5mmol/L Zn²⁺可使HE的活性提高为原来的215％，而其它金属离子如Ca²⁺、Mg²⁺和Cu²⁺对该酶活性没有影响或影响不显著，表明卤虫孵化酶很可能又是一种Zn-金属蛋白酶。免疫细胞化学染色结果显示，卤虫HGC最早出现于孵化前2h，于孵化后5h消失。卤虫HGC于孵化前2h刚刚出现时，胚胎中的HE颗粒界限不明显且数量较少，颜色也很淡，遍布于整个胚体；随胚胎的进一步发育，HGC的数量逐渐增多、颜色也逐渐变深，在孵化时达到最大，之后颗粒量便开始逐渐减少、颜色也逐渐变浅；孵化后2h的幼体中，HE阳性反应减弱，于胚胎局部已开始消失，且主要集中在胚胎中央及胚胎体表，最终于孵化后5h小时消失。卤虫HGC最初出现至孵化前1h时均为全身性分布，从孵出到孵出后2h，头卤虫孵化酶的生物化学性质及孵化腺细胞的免疫组织化学研究部的孵化酶颗粒已经减少，而变为非全身性分布，到孵出后sh，孵化酶颗粒已基本消失殆尽。卤虫胚胎的头部很可能是孵化酶的最早开始分泌的部位，可能也是主要的分泌部位，随着胚胎的继续孵出，身体背部继而腹部等部位也开始分泌孵化酶，以协助胚胎完全孵出。孵出后仍残留的孵化酶有可能参与了卤虫幼体内残余卵黄颗粒的消化降解，此结论还需进一步验证。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
第一章动物孵化酶的研究进展  11-26
  1 孵化酶的生物化学性质  11-16
    1.1 鱼类的孵化酶  12-13
    1.2 两栖类的孵化酶  13-14
    1.3 海胆的孵化酶  14-15
    1.4 其它物种的孵化酶  15-16
  2 孵化酶基因的结构及其时空表达  16-20
    2.1 鱼类HE基因  16-17
    2.2 两栖类HE基因  17-18
    2.3 海胆HE基因  18-20
  3 孵化酶对卵膜的作用  20-21
  4 孵化酶合成及分泌的影响因素  21-24
    4.1 缺氧引起的孵化酶的分泌  21-22
    4.2 温度对孵化酶分泌的影响  22
    4.3 光照对孵化酶分泌的影响  22-23
    4.4 激素对孵化酶分泌的影响  23
    4.5 其他影响因素  23-24
  5 孵化酶的研究价值及其应用前景  24-26
第二章卤虫孵化酶的分离纯化及其性质研究  26-45
  1 实验用品  26-28
    1.1 实验材料  26-27
    1.2 实验仪器  27
    1.3 实验药品  27
    1.4 常用溶液配方  27-28
  2 实验方法  28-35
    2.1 卤虫卵的人工孵化  28-29
    2.2 孵化液的制备  29
    2.3 卵膜的制备  29
    2.4 孵化酶样品的酶活性分析  29-30
    2.5 蛋白质的定量测定  30-31
    2.6 孵化酶的纯化  31-32
    2.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  32
    2.8 孵化酶生物化学性质的鉴定  32-35
  3 实验结果  35-41
    3.1 卤虫孵化酶的纯化  35-38
    3.2 孵化酶的生物化学性质  38-41
  4 讨论  41-43
  5 结论  43-45
第三章卤虫(Artemia shrimp)孵化腺细胞免疫化学研究  45-59
  1 实验用品  46-47
    1.1 实验材料  46
    1.2 实验仪器  46
    1.3 实验药品  46
    1.4 常用溶液配方  46-47
  2 实验方法  47-48
    2.1 卤虫卵的孵化  47
    2.2 胚胎的取材  47
    2.3 胚胎的固定  47
    2.4 梯度酒精脱水  47-48
    2.5 透明、浸蜡与包埋  48
    2.6 石蜡切片  48
    2.7 酶标抗体染色  48
  3 实验结果  48-55
    3.1 激活发育后15h胚胎  49-50
    3.2 激活发育后23h胚胎(E1期)  50
    3.3 激活发育后25h胚胎(E2.1期)  50-51
    3.4 孵化26h胚胎(E2.2期)  51-52
    3.5 孵化27h胚胎(N-0期)  52
    3.6 孵化28h胚胎(N0.1期)  52-53
    3.7 孵化29h胚胎(N0.2期)  53-54
    3.8 孵化32h胚胎(N0.5期)  54-55
  4 讨论  55-57
  5 结论  57-59
参考文献  59-64

卤虫（Artemia Shrimp）孵化酶的生物化学特性及孵化腺细胞的免疫细胞化学研究

内容摘要

全文目录

相似论文