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治疗阿兹海默病多肽药物的筛选及其功能研究

作　者: 杨世高
导　师: 汪维云；刘瑞田
学　校: 安徽农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 阿兹海默病 β淀粉样肽淀粉样前体蛋白 β-分泌酶
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

阿兹海默病(AD)是一种复杂的、由多种因素引起的主要以记忆力下降和脑内形成老年斑为特征的老年人神经退行性疾病。当前人们普遍认为由β-淀粉样肽(Aβ)单体聚集成具有细胞毒性作用的聚集物是AD发生的主要诱因。Aβ是由β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶水解加工淀粉样前体蛋白(APP)产生。因此,抑制β-,γ-分泌酶酶切作用就可以抑制Aβ的产生。但是,β-,γ-分泌酶还参与其他非APP底物的酶切作用,单纯抑制β-,γ-分泌酶会造成许多副作用。然而,结合APP上β-酶切位点的抑制剂能够阻止BACE酶切作用,从而减少Aβ的产生,并同时可避免许多副作用的发生。本研究以含有APP上β-分泌酶酶切位点和AβN末端的多肽为底物应用噬菌体展示技术,淘选出了21个阳性克隆,通过对这些阳性克隆DNA测序和氨基酸序列比对分析获得6组有意义的共有序列,将共有序列重组合成得到具有潜在治疗功能的候选多肽。ELISA结果表明,这些多肽能以较高的亲和力特异与β-位点和Aβ结合。ThT荧光染色和透射电镜结果表明,结合AβN末端的多肽一般能够促进Aβ聚集,另外一些多肽对Aβ的聚集没有明显的影响,而其它一些多肽则可抑制聚集,但所有多肽都能降低Aβ42引起的细胞毒性作用。对几种候选多肽进一步研究表明,多肽LY3、S1、S6、G5可以明显抑制转APP基因的7PA2细胞对Aβ的产生作用。将多肽S1侧脑室注射转基因鼠的体内实验结果表明,S1可以明显提高小鼠的空间记忆能力,并降低脑内老年斑的数量。这种在体内外能够同时抑制Aβ产生和Aβ聚集及细胞毒性的小分子多肽,具有副作用小,易穿透血脑屏障等优势,对AD的治疗具有较大的潜在应用价值。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
英文缩写词表  7-8
1 文献综述  8-17
  1.1 阿兹海默病概述  8-9
  1.2 淀粉样级联假说  9-13
    1.2.1 APP 的蛋白酶水解和Aβ产生  9-10
    1.2.2 Aβ与AD  10-13
  1.3 AD 治疗概述  13-16
    1.3.1 对症治疗  13-14
    1.3.2 具有可能减轻疾病作用的候选药物  14-15
    1.3.3 针对其他靶点的药物发现  15-16
  1.4 噬菌体展示技术  16-17
2 引言  17-19
3 材料与方法  19-48
  3.1 实验材料  19-22
    3.1.1 多肽合成及试剂盒  19
    3.1.2 细胞来源  19-20
    3.1.3 实验动物及分组  20
    3.1.4 主要试剂及仪器  20
    3.1.5 主要培养基及试剂的配制  20-22
  3.2 实验方法  22-31
    3.2.1 ER2738 宿主菌的扩增  22
    3.2.2 噬菌体滴度的测定  22-23
    3.2.3 多肽库淘选程序  23-24
    3.2.4 结合克隆的特征鉴定  24-26
    3.2.5 ELISA 检测合成多肽与底物多肽的结合情况  26
    3.2.6 目的多肽的重组与合成  26-27
    3.2.7 ELISA 检测目的多肽与Aβ42 结合活性分析  27
    3.2.8 目的多肽对7PA2 细胞产生Aβ的影响  27-28
    3.2.9 目的多肽对Aβ聚集的影响  28
    3.2.10 目的多肽对Aβ引起的细胞毒性的影响（MTT）  28-29
    3.2.11 目的多肽对APP/PS1 转基因鼠动物行为学及老年斑的影响  29-31
  4 结果与分析  31-48
    4.1 结合APP 上β-分泌酶酶切位点和AβN 末端的噬菌体多肽库的筛选及结合特性分析  31-39
      4.1.1 特异性噬菌体的富集  31
      4.1.2 阳性克隆噬菌体的获得及氨基酸序列比对分析  31-32
      4.1.3 噬菌体克隆的结合活性分析  32-34
      4.1.4 合成多肽与β-分泌酶酶切位点和Aβ的N 末端结合特性分析  34-38
      4.1.5 目的多肽与Aβ42 结合情况  38-39
    4.2 结合APP 上β-分泌酶酶切位点及AβN 末端多肽的功能研究  39-48
      4.2.1 目的多肽对7PA2 细胞产生Aβ的影响  39-41
      4.2.2 目的多肽对Aβ聚集的影响  41-43
      4.2.3 目的多肽降低Aβ引起的细胞毒性  43-44
      4.2.4 目的多肽 S1 改善 APP/PS1 转基因小鼠学习与记忆能、加速老年斑的清除  44-48
5 讨论  48-51
6 结论  51-52
  6.1 研究总结  51
  6.2 需要进一步开展的工作  51-52
参考文献  52-59
致谢  59-60
作者简介  60-61

治疗阿兹海默病多肽药物的筛选及其功能研究

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