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家族性阿尔茨海默病基因突变筛选及APP表达载体的构建

作　者: 徐少华
导　师: 郑妍鹏；彭向雷
学　校: 北京交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 阿尔茨海默病 基因突变 淀粉样前体蛋白
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人群常见的渐进性神经退行性疾病。临床及实验研究已确定3种导致早发家族性AD (FAD)的基因,即淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素-1(presenilin 1, PS-1)和早老素-2(presenilin 2, PS-2)。目前已有AD家系的基因突变数据大都来自国外,国内鲜有报道。为了解国内FAD的致病基因突变情况,本研究对部分中国人群中上述三个基因的突变热点进行检测分析；对于新发突变,进行初步的分子机制研究。方法：收集AD患者及其亲属的外周血样本,提取基因组DNA,针对PS-1和PS-2基因的编码外显子和APP外显子16、17设计引物,PCR扩增基因外显子后测序筛选相关基因突变。对于检测到的新发突变,采用Megaprimer-PCR法构建相应基因的cDNA突变体和真核表达质粒载体,经脂质体法转染HEK293细胞,G418筛选稳定表达细胞株；为在神经细胞中高效表达和研究FAD突变体的致病机理,本研究构建了重组腺病毒穿梭质粒,Pme I线性化后转化AdEasier(含有pAdEasy-1质粒的BJ5183)感受态细胞构建重组腺病毒质粒,经Pac I酶切乙醇沉淀后脂质体法转染HEK293细胞包装重组腺病毒,并用Western Blot进行鉴定。结果：AD临床样本致病基因的测序结果显示本研究筛选到一个PS-1基因的突变(R278I)和一个APP基因的新突变(K724X)。构建的APP695野生型及突变型真核表达质粒pcDNA3.1(-)-APP695WT、pcDNA3.1(-)-APP695K724X和pcDNA3.1 (-)-APP695K724N经过了菌液PCR和测序鉴定,获得了相应的HEK293稳定表达细胞株。构建的重组腺病毒质粒pAd-APP695WT、pAd-APP695K724X和pAd-APP695K724N,经过了菌液PCR和测序鉴定,Western Blot鉴定结果显示重组腺病毒包装成功。结论：本研究筛选到一个PS-1基因的突变(R278I)和一个新的导致FAD的APP基因突变(K724X)；构建了APP695相应的真核表达载体,建立了稳定表达HEK293细胞株；构建并成功包装了重组腺病毒,为深入研究FAD的发病机制和药物筛选奠定基础。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-10
1 引言  10-14
  1.1 研究背景  10-12
  1.2 国内外研究现状  12-13
  1.3 实验设计和流程  13-14
2 材料和方法  14-39
  2.1 材料  14-17
    2.1.1 质粒载体  14
    2.1.2 细菌菌株  14
    2.1.3 细胞株  14
    2.1.4 主要工具酶及试剂  14-15
    2.1.5 主要试剂盒及耗材  15
    2.1.6 主要试剂的配制  15-16
    2.1.7 主要仪器  16-17
  2.2 方法  17-39
    2.2.1 AD外周血样本的收集及基因组DNA的提取  17-18
    2.2.2 PS-1、PS-2和APP各外显子扩增引物的设计合成  18-20
    2.2.3 基因突变的筛选  20
    2.2.4 APP695真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的建立  20-28
    2.2.5 APP腺病毒表达载体pAd-APP695X的构建及腺病毒包装  28-39
3 结果  39-55
  3.1 AD外周血样本的收集情况  39-40
  3.2 PS-1,PS-2编码外显子及APP外显子16、17的扩增结果  40-41
  3.3 基因突变筛选的部分测序结果  41-44
  3.4 pcDNA3.1(-)-APP695X的构建及稳定表达细胞株的建立  44-49
    3.4.1 APP695WT基因片段的PCR扩增  44-45
    3.4.2 APP695突变基因片段(APP695mutation)的PCR扩增  45-46
    3.4.3 pcDNA3.1(-)-APP695X的菌液PCR鉴定  46-48
    3.4.4 稳定表达多克隆细胞株的建立  48-49
  3.5 pAd-APP695X的构建及腺病毒Ad-APP695X的包装  49-55
    3.5.1 穿梭质粒pShuttleCMV-APP695X的构建  49-50
    3.5.2 重组腺病毒质粒pAd-APP695X的构建  50-51
    3.5.3 腺病毒Ad-APP695X的包装  51-52
    3.5.4 腺病毒Ad-APP695X的鉴定  52
    3.5.5 腺病毒Ad-APP695X的滴度测定  52-55
4 讨论  55-57
5 结论  57-58
参考文献  58-61
附录A  61-62
作者简历  62-64
学位论文数据集  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 精神病学 > 脑器质性精神障碍 > 老年及早老性精神障碍
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