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植物激活蛋白的分离、纯化及结构分析

作　者: 郭广君
导　师: 王荣富；邱德文
学　校: 安徽农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 交链孢菌植物激活蛋白分离纯化理化性质晶体生物活性
分类号: Q946.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本研究以交链孢菌为材料,进行植物激活蛋白的提取、分离、纯化和理化性质鉴定,并对糖蛋白的结构和功能进行了初步研究,为进一步研究植物激活蛋白及其作用机理奠定理论基础。结果如下:1.交链孢菌在28℃恒温振荡培养72h,66KD蛋白质量达到最大。用70%、80%乙醇提取,66KD蛋白质提取量最大,说明66KD蛋白是醇溶蛋白。20%-30%饱和度的硫酸铵,沉淀的总蛋白含量最高,约占蛋白总量的43.23%。双向电泳结果表明,激活蛋白的等电点大多集中在酸性区域。2.利用离子交换层析技术进行粗蛋白纯化,用pH3.5、pH4.0醋酸缓冲液洗脱得到两个具有生物活性的目的蛋白,其分子量分别为66KD和45KD。用离子交换层析梯度洗脱的分离效果较好,但所需时间长。初步纯化的66KD蛋白质通过脱盐处理,以除去其中的盐类、小分子杂质及降解的小肽段。然后利用分子筛层析进行精细纯化,获得66KD蛋白质,经检测表明具有生物活性。3.糖蛋白的鉴定。利用12%Native-PAGE和12%SDS-PAGE进行蛋白质纯度和分子量检测,经纯化后获得66KD和45KD蛋白质,达银染电泳纯。凝胶经糖蛋白特异性染色后发现,66KD蛋白质为糖蛋白。紫外光谱扫描发现,该蛋白质的特征吸收峰为257nm。测得该糖蛋白糖与蛋白比值为1.75。利用PNGase F酶和β-消去反应进一步鉴定糖蛋白的连接方式,证明糖蛋白中存在O-糖苷键。该糖蛋白对胃蛋白酶敏感,对胰蛋白酶不敏感,切割后获得约53KD的肽段和10KD的小肽。4.糖蛋白异型鉴定。利用SDS-PAGE、切胶回收,以及等电聚焦技术,进行了糖蛋白异型鉴定。结果表明,交链孢菌在摇床培养48h时,糖蛋白异型最为明显,出现三种异型体,等电点分别约为3.5、3.7和4.3,与该糖蛋白在离子交换柱上的结果相同。5.对糖蛋白进行肽指纹图谱分析,在Mascot站点对所得数据进行检索分析,未发现于之相匹配的肽指纹图谱,提示可能为一新的糖蛋白。6.蛋白质结构分析。分别用CH3OH:H2O=1:1(V/V)、CH3OH:H2O=1:20(V/V)、H2O三种溶剂溶解糖蛋白,在190nm～240nm波长范围内,进行圆二色光谱扫描。结果表明具有α螺旋、β折叠、转角和无规则卷曲四种二级结构类型。用有机相CH3OH微扰后,α螺旋结构含量为15.8%,没有发生变化;β折叠含量由46.1%逐渐变化为48.6%,有增加的趋势;在由有机相向水相过渡的过程中,转角含量由13.5%下降至6.2%,无规则卷曲含量增加。7.蛋白质晶体生长条件的摸索及鉴定。利用Crystal Screen TM HR2-110和Crystal Screen TM HR2-112的98种条件作为池液,进行结晶条件的摸索,于16℃,在Crystal Screen TM HR2-110的第14号缓冲液条件下获得蛋白质晶体,由于衍射点较少,未获得理想的衍射数据。8.进行糖蛋白的生物活性测定。用糖蛋白液对小麦种子浸泡6h后,分别于2天后测定萌发势、5天后测定幼苗株高。生物活性测定结果表明:2天后种子萌发势分别为93.62%、97.87%和93.61%,与对照萌发势87.15%相比明显提高,方差分析表明,在p﹤0.05条件下存在显著性差异,其中2μg/ml处理效果最佳。经不同浓度处理后,小麦生长5天后植株高度均高于对照。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-8
1 文献综述  8-17
  1.1 微生物蛋白农药研究进展  8-12
  1.2 糖蛋白的结构与功能分析方法  12-17
2 前言  17-18
3 材料和方法  18-32
  3.1 实验材料  18-19
  3.2 实验方法  19-32
4 实验结果和分析  32-49
  4.1 交链孢菌的培养  32-33
  4.2 植物激活蛋白分离方法比较  33-36
  4.3 蛋白质浓度标准曲线  36
  4.4 蛋白质等电点和分子量  36
  4.5 植物激活蛋白的柱纯化  36-39
  4.6 植物激活蛋白理化性质的测定  39-45
  4.7 植物激活蛋白结构分析  45-47
  4.8 糖蛋白生物活性鉴定  47-49
5 讨论  49-53
6 结论  53-55
参考文献  55-60
附录  60-65
致谢  65-66
作者简介  66
在读期间发表或被接受的论文  66

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