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四川红景天的组织培养及其抗性基因表达情况的检测

作　者: 白丽莉
导　师: 任正隆
学　校: 电子科技大学
专　业: 生物物理学
关键词: 红景天 植物组织培养 抗性基因 营养条件
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


红景天作为一种珍贵藏药植物,因其具有清热解毒和燥湿的功效,早期主要用于治疗肺炎以及由传染病引起的发烧和清血管热,现认为其还具有抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗紫外线辐射等作用,是非常有开发前途的环境适应性药用植物。红景天生长环境极其恶劣且多变,如缺氧、低温干燥、狂风、强紫外线照射、昼夜温差大等,这使其具备了其它植物所罕有的特殊适应性物质,也导致其自然资源极其匮乏。红景天种子繁殖相当困难,由高山引种至低海拔地区进行驯化栽培时病虫害发生很严重,加上人们大量地采挖其野生资源,使得其已濒临灭绝的境地。因此加强红景天的组织培养及其快速繁殖,保护其自然资源及其遗传多样性极其迫切。中国有红景天属植物73种,其中以云南、四川及西藏的种类最多,西藏有32种,四川省有22种。现有不少关于云南和西藏红景天的组织培养报道,但未见有关四川红景天组织培养的报道。本研究首次对四川野生红景天进行组织培养,并成功获得其愈伤组织和再生植株。在组织培养过程中,我们研究不同的取材时间、不同的外植体以及不同的营养条件对红景天愈伤组织诱导的影响、植物激素对愈伤组织的分化和生根培养等方面的影响,以及组织培养几个时期抗性基因表达的情况。研究结果如下:1.一年中最佳的取材时间是10月份,外植体成愈率最高,达到78%以上。2.在大花红景天愈伤组织诱导过程中,茎段显示出比叶片更易于诱导愈伤组织。在长鞭红景天愈伤组织培养过程中,叶片比茎段显示出更易于诱导愈伤组织。3. 2,4-D与NAA比较,其能够较早的启动愈伤化,2,4-D启动愈伤化,只需要5d时间,而NAA启动时间至少需要10 d。2,4-D诱导出的愈伤组织结构致密,高浓度(4mg/L)启动愈伤化需要时间更短。NAA诱导出的愈伤组织呈现淡黄绿色,而且结构比较蓬松,活性强,很容易诱导分化出芽。用低浓度的2,4-D(2mg/L)和中等浓度的NAA(0.2mg/L)配合诱导愈伤组织,能够较早启动愈伤化,且愈伤组织比较容易分化。植物激素6-BA 2mg/L、NAA 0.2mg/L、2,4-D 2mg/L、KT 0.5mg/L)组合诱导出的愈伤组织最好,愈伤组织淡黄绿又有光泽,结构蓬松,容易诱导出芽而且出芽多。4.在植物激素和蔗糖的组合中,最佳的浓度组合是6-BA 2mg/L,NAA 0.2mg/L,蔗糖40g/L。高浓度的蔗糖有利于愈伤组织的分化。5.检测红景天组织培养过程中各个阶段的培养物的抗性基因表达情况,发现11个特异表达的基因,其中大部分基因与抗病性有关,3个基因未知其功能,这表明组织培养具有特殊的生理活动。利用红景天植物组织培养,我们除了可快速繁殖出大量的红景天种苗及多种代谢物质外,还可获其大量的优良无性系、单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体,与细胞融合技术结合打破红景天种属间的界限,克服远缘杂交不亲和性障碍,培育红景天植物新品种和改良其种性。组织培养的植物细胞还是在细胞水平上分析研究的理想材料。因此通过红景天的组织培养我们可以进一步研究红景天的生理学、遗传学、育种学、胚胎学、解剖学、病理学、生物制药、以及生物化学等方面,以期全面研究、开发、利用和保护红景天植物。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章 绪论  11-27
  1.1 红景天属植物研究进展  11-19
    1.1.1 红景天属植物的生态学研究  11-12
    1.1.2 红景天属植物的化学成分和药理作用研究  12-19
  1.2 红景天植物的开发与利用  19-23
    1.2.1 产品开发  19-20
    1.2.2 红景天属植物的栽培研究  20-21
    1.2.3 组织培养研究  21-22
    1.2.4 细胞培养  22
    1.2.5 人工合成红景天苷  22-23
  1.3 红景天濒危原因的分析  23-24
    1.3.1 内因  23
    1.3.2 外因  23-24
  1.4 组织培养设计方法  24
  1.5 组培过程中抗性研究  24-25
  1.6 立题依据和主要内容  25-27
第二章 实验材料和方法  27-39
  2.1 材料  27
  2.2 试验设计  27
  2.3 方法  27-31
    2.3.1 配制培养基  27-30
    2.3.2 取材  30
    2.3.3 接种  30
    2.3.4 培养条件  30
    2.3.5 愈伤组织的诱导  30-31
    2.3.6 愈伤组织的分化  31
    2.3.7 生根培养  31
  2.4 愈伤组织生长情况统计  31-32
    2.4.1 愈伤组织生长势  31-32
    2.4.2 愈伤组织生长情况统计计算公式  32
    2.4.3 愈伤组织分化出芽和生根情况统计  32
  2.5 抗性基因表达情况的检测  32-39
    2.5.1 总DNA 和总RNA 的提取  32-35
    2.5.2 引物设计与合成  35
    2.5.3 PCR 扩增  35-36
    2.5.4 RT-PCR 扩增  36
    2.5.5 RT-PCR 扩增片段回收、克隆及测序  36-39
第三章 结果和分析  39-51
  3.1 外植体取材时间和部位  39-41
    3.1.1 不同取材时间对茎段和叶片成活率和愈伤组织启动情况的影响  39-40
    3.1.2 不同取材时间对茎段和叶片成愈率及生长诱导值的影响  40-41
  3.2 植物激素的作用  41-44
    3.2.1 愈伤组织的诱导情况  41-42
    3.2.2 愈伤组织分化情况  42-43
    3.2.3 生根培养情况  43-44
  3.3 抗性基因的检测  44-51
    3.3.1 PCR 扩增电泳结果  44
    3.3.2 RT-PCR 扩增电泳结果  44-45
    3.3.3 RT-PCR 克隆测序及比对结果  45-51
第四章 讨论  51-60
  4.1 外植体的取材  51-53
  4.2 植物激素的作用  53-55
    4.2.1 植物激素对愈伤组织诱导的效应  53-54
    4.2.2 6-BA 和2,4-D 对愈伤组织分化出芽的效应  54-55
    4.2.3 NAA 对生根培养的效应  55
  4.3 碳源的影响  55-56
  4.4 组织培养过程中抗性基因的表达  56-59
  4.5 结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-67
硕士期间取得的研究成果  67-68

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