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重组人源前列腺特异性抗原（rPSA）-hFc融合蛋白在昆虫细胞中的表达与研究

作　者: 袁建伟
导　师: 孙兵
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物医药与技术
关键词: 前列腺特异性抗原(PSA) 前列腺特异性抗原诊断试剂盒标准品 Bac to Bac 昆虫细胞真核表达酶联免疫吸附法(ELISA)
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

近年来,数以千计的不同种类蛋白已经成功利用昆虫细胞表达系统进行表达,其中包括多种蛋白酶,细胞表面蛋白。昆虫细胞表达出的蛋白具有较好的空间构型,糖基化修饰,并且表达量也相对较高,因此利用昆虫细胞表达系统表达出的蛋白,被广泛用在蛋白质功能、蛋白质相互作用的研究中,并在产品开发中被用于制备高效疫苗。在以往前列腺特异性抗原(PSA)检测试剂盒中,标准品通常是由天然蛋白纯化而来,但这种标准品存在诸多缺点,如批次间稳定性差,不利于纯化得到单一形式蛋白,纯化成本较高等等,为了解决这些问题,本实验利用昆虫细胞表达系统Bac to Bac表达重组前列腺特异性抗原。为方便纯化提高重组前列腺特异性抗原的稳定性,使用人源IgG2的Fc片段融合PSA进行表达。实验中,在昆虫细胞中表达并纯化出的PSA-Fc融合蛋白,标准品的替代实验证明重组PSA可以有效替代PSA国际标准品,本实验为前列腺特异性抗原诊断试剂盒的标准品替代奠定了基础。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-6
前言  6-7
第一篇实验部分  7-45
  第一章材料与方法  7-20
    1.1 材料  7-11
      1.1.1 Bac to Bac 细胞表达系统  7
      1.1.2 溶液  7-10
      1.1.3 培养液  10
      1.1.4 PSA 单克隆抗体  10-11
      1.1.5 其他  11
    1.2 方法  11-20
      1.2.1 CRL-1740 前列腺癌细胞系的培养  11-12
      1.2.2 CRL-1740 前列腺癌细胞系的RNA 抽提与反转录  12
      1.2.3 PSA 的基因克隆  12-14
        1.2.3.1 PSA 的巢式 PCR 克隆  12-13
        1.2.3.2 扩增产物的酶切验证  13-14
        1.2.3.3 扩增产物胶回收后进行T 载体转化  14
      1.2.4 pFastBac-Fc-GP64 质粒的构建  14-15
        1.2.4.1 GP64 信号肽的构建  14
        1.2.4.2 人源IgG2Fc 的克隆并引入HindIII 和XhoI 酶切位点  14-15
      1.2.5 重组PSA 杆状病毒的获得与蛋白表达的验证  15-16
        1.2.5.1 Donor 质粒转化DH10BacTM  15
        1.2.5.2 Bacmid-PSA 重组杆粒的抽提  15
        1.2.5.3 重组杆粒的验证  15-16
      1.2.6 PSA 重组杆状病毒的获得  16
        1.2.6.1 HighFive 昆虫细胞的培养  16
        1.2.6.2 PSA 重组杆状病毒的包装与获得  16
      1.2.7 PSA 蛋白的大量表达  16-17
        1.2.7.1 High Five 细胞的悬浮驯化培养  16-17
        1.2.7.2 High Five 细胞表达重组PSA-Fc  17
      1.2.8 PSA 蛋白纯化  17
      1.2.9 PSA 抗体的纯化和辣根过氧化物酶(HRP)的标记  17-20
        1.2.9.1 硫酸铵盐析法纯化抗体  17
        1.2.9.2 抗体与HRP 酶的交联（戊二醛两步法）  17-18
        1.2.9.3 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）  18
        1.2.9.4 夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）  18-19
        1.2.9.5 Western-Blot  19-20
  第二章结果  20-39
    2.1 PSA 基因的克隆  20-24
      2.1.1 CRL-1740 前列腺癌细胞株的RNA 抽提  20-21
      2.1.2 PSA 基因的巢式 PCR  21-24
    2.2 pFASTBac-Fc-GP64 质粒的构建  24-26
    2.3 pFastBac-PSA-GP64-Fc 转移质粒的构建  26-27
    2.4 重组PSA 杆状病毒的制备与扩增  27-28
    2.5 重组PSA 杆状病毒的制备  28-29
    2.6 High Five 昆虫细胞的大规模培养与蛋白的制备  29-33
    2.7 Biocheck 游离PSA 检测试剂盒检测国际标准品和 rPSA在Biocheck 试剂盒中的相关性  33-34
    2.8 自制游离PSA 检测试剂盒检测国际标准品和rPSA 在自制游离PSA 检测试剂盒中的相关性  34-36
    2.9 自制总PSA 检测试剂盒衡量国际标准品，重组纯化PSA作为标准品的线性相关性  36-39
  第三章讨论  39-42
  已申请专利  42-43
  参考文献  43-45
文献综述  45-58
  一、蛋白纯化前必要的信息收集  45-46
  二、蛋白样品的提取  46
  三、蛋白的分离  46-52
  四、抗体的工程化纯化  52-57
  参考文献  57-58
附录I--已申请专利  58-59
附录II—PSA 基因克隆测序比对结果  59-61
附录III—GP64 信号肽测序比对结果  61-62
附录IV—HumanIgG2Fc 测序比对结果  62-65
致谢  65

重组人源前列腺特异性抗原（rPSA）-hFc融合蛋白在昆虫细胞中的表达与研究

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