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家蝇ceropin基因在昆虫细胞中的表达

作　者: 周秀娟
导　师: 牛长缨
学　校: 华中农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 家蝇抗菌肽cecropin基因 Bac to Bac表达系统 S2细胞
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


家蝇抗菌肽具有理化性质稳定、抗菌谱广、特异性强等特点,在当前许多抗生素产生抗药性、开发新型抗生素困难的形势下,对家蝇抗菌肽的研究在农业、医药、食品等领域具有重要的科学意义。由于抗菌肽在家蝇的正常组织中含量很少,分离纯化难度较大,而化学合成的成本又十分昂贵,因此通过基因工程技术来获得抗菌肽成为首选方法。本文利用大肠杆菌侵染家蝇三日龄幼虫,通过提取其总RNA,以cDNA为模板,扩增cecropin基因的带有信号肽的序列,将其克隆到pMD18-T载体上,经序列测定与GenBank中的cecropin基因一致,成功获得含有信号肽的开放阅读框（ORF为192bp）的pMD18-T-C。该载体为进一步将家蝇cecropin基因在不同的表达系统中表达奠定基础。采取了Bac to Bac表达系统,对cecropin基因进行重组表达,该系统具有高效表达、翻译后修饰、无内毒素污染等优势。将cecropin基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA,将重组质粒pFastBacHTA-cec转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,发生体内重组,获得杆粒Bacmid-cec。杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染粉纹夜蛾Trichoplusia ni细胞（Tn-581-4）,获得含cec基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,表达目的蛋白。SDS-PAGE分析和Western blot显示,目的蛋白成功表达。将cecropin基因亚克隆到果蝇的转座子载体P-因子,在脂质体Lipofectin介导作用下,将P-C-N和含有转座酶的Hepler转入果蝇S2细胞,进行瞬时表达,通过细胞RT-PCR的方法检测表明cecropin基因能够在果蝇S2细胞中表达,这一结果作为在转基因果蝇中表达cecropin基因的体外检测,同时确定了G418对S2细胞的最佳筛选浓度850μg/ml,为果蝇的S2细胞稳定表达家蝇cecropin基因提供依据。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语表  9-10
第一章 文献综述  10-26
  1.1 引言  10-11
  1.2 天然抗菌肽的研究进展  11-17
    1.2.1 抗菌肽的分类  11-12
    1.2.2 抗菌肽的活性  12-14
    1.2.3 抗菌肽的应用前景  14-15
    1.2.4 家蝇抗菌肽  15-16
    1.2.5 用基因工程方法表达家蝇cecropin基因的研究现状  16-17
  1.3 杆状病毒载体表达系统  17-20
    1.3.1 昆虫杆状病毒表达系统的优缺点  17
    1.3.2 Bac to Bac表达系统的原理  17-19
    1.3.3 昆虫杆状病毒表达系统的发展  19-20
  1.4 昆虫转座子介导的外源基因的表达  20-22
    1.4.1 昆虫转座子  20-21
    1.4.2 介导外源基因的表达  21-22
  1.5 研究内容  22-23
    1.5.1 家蝇cecropin基因的克隆  22
    1.5.2 家蝇cecropin基因在Tn细胞中的表达  22
    1.5.3 P转座子介导的果蝇S2细胞中家蝇cecropin基因的表达  22-23
  1.6 技术路线  23
  1.7 研究目的和意义  23-24
  1.8 研究创新点  24-26
第二章 家蝇cecropin基因的克隆  26-36
  2.1 材料与方法  26-32
    2.1.1 实验材料  26-28
    2.1.2 试验方法  28-32
  2.2 试验结果  32-34
    2.2.1 总RNA检测  32-33
    2.2.2 家蝇cecropin基因克隆  33
    2.2.3 家蝇cecropin基因序列分析  33-34
  2.3 讨论  34-36
第三章 家蝇cecropin基因在Tn细胞中的表达  36-52
  3.1 材料与方法  36-44
    3.1.1 试验材料  36-40
    3.1.2 实验方法  40-44
  3.2 实验结果  44-49
    3.2.1 pMD_(18)-T-cecl的酶切鉴定  44-45
    3.2.2 转移质粒pFastBac1HTA-cec酶切鉴定  45-46
    3.2.3 重组Bacmid的获得  46-47
    3.2.4 感染细胞的形态变化  47-48
    3.2.5 Cecropin基因在昆虫细胞中的表达  48-49
  3.3 讨论与展望  49-52
第四章 P转座子介导的果蝇S2细胞中家蝇cecropin基因的表达  52-64
  4.1 材料与方法  52-58
    4.1.1 实验材料  52-54
    4.1.2 试验方法  54-58
  4.2 试验结果  58-62
    4.2.1 质粒P-C-N双酶切和PCR检测  58-60
    4.2.2 G418对S2细胞的最佳抗性浓度  60
    4.2.3 家蝇cecropin基因在S2细胞中的瞬时表达  60-62
  4.3 讨论  62-64
第五章 小结与展望  64-66
  5.1 小结  64
    5.1.1 家蝇cecropin基因的克隆  64
    5.1.2 家蝇cecropin基因在Tn细胞中的表达  64
    5.1.3 P转座子介导的果蝇S2细胞中家蝇cecropin基因的表达  64
  5.2 展望  64-66
参考文献  66-74
致谢  74-76
附录  76

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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