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滋补脾阴药物血清对内质网应激神经元凋亡的影响及其机制

作　者: 韦巍
导　师: 战丽彬
学　校: 大连医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 内质网应激神经元凋亡滋补脾阴药物血清 GRP78 CHOP
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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引　用: 2次
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内容摘要

目的:内质网(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白质合成、修饰以及折叠的重要场所。内质网内未折叠蛋白堆积,钙离子失稳态可引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS),内质网通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)纠正这些异常变化。过度的内质网应激将导致细胞损害和死亡。近年来的研究发现阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的神经系统损害与内质网应激异常有关。深入研究内质网应激将为进一步探索阿尔茨海默病发病机制和防治基础提供新的方向。本课题组既往研究表明,滋补脾阴方药(Zi-Bu-Pi-Yin, ZBPY)具有显著的神经保护和抗脑衰老作用。因此深入研究滋补脾阴方药的神经保护作用与内质网应激神经元凋亡的相关性及其机制,对于AD等神经退行性疾病的防治具有重要意义。本研究以N-糖链抑制剂衣霉素(tunicamycin, Tm)刺激小鼠神经瘤母细胞(Neuro2a)所致内质网应激为模型,ZBPY含药血清为干预组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察Tm刺激后细胞生存率;流式细胞方法检测Neuro2a细胞凋亡;蛋白质免疫印迹(Western blot)法观察分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein78,GRP78)、凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/EBP homologous protein, CHOP)的蛋白水平的表达,以探讨滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元凋亡的影响及其机制;揭示滋补脾阴方药对神经细胞凋亡的影响可能与内质网途径相关,为防治脑老化、AD提供新的理论依据;通过血清药理学的方法深入探讨ZBPY方药的药效及有效成分的作用机制。方法:1.正常培养Neuro2a细胞,细胞单层长至70-80%时给予终浓度为5μg/ml的Tm刺激,实验中设空白对照组、10%空白血清组、Tm组(5μg/ml)、5%、10%、15%ZBPY含药血清组及10%空白血清、5%、10%、15%ZBPY含药血清预处理组,刺激48小时后收集细胞,用MTT法检测各组细胞生存率。2.正常培养Neuro2a细胞,细胞单层长至70-80%时给予终浓度为5μg/ml的Tm刺激,实验分组同前,刺激48小时后收集细胞,用流式细胞方法检测各组细胞凋亡率,确定ZBPY含药血清对Tm诱导的Neuro2a细胞凋亡的作用。3.正常培养Neuro2a细胞,细胞单层长至80%时给予终浓度为5μg/ml的Tm刺激,实验中设空白对照组、10%空白血清组、10%ZBPY含药血清组、Tm(5μg/ml)组及10%空白血清、5%、10%、15%ZBPY含药血清预处理组,刺激24小时后收集细胞,运用Western blot法观察GRP78、CHOP蛋白水平的表达。结果:1.MTT实验结果表明,各浓度血清组与空白对照组相比,细胞生存率没有显著差异;Tm(5μg/ml)组与空白对照组相比,细胞生存率显著降低,有显著性差异(P<0.01);空白血清及各浓度ZBPY含药血清预处理组细胞生存率较Tm组升高,而ZBPY含药血清预处理组细胞生存率较空白血清预处理组升高明显(P<0.05)。2.流式细胞实验结果显示,各浓度血清组与空白对照组相比,细胞凋亡率没有显著差异; Tm(5μg/ml)组与空白对照组相比,细胞凋亡率显著升高(P<0.01);而加入ZBPY含药血清预处理1h后再加入Tm(5μg/ml),各组与Tm(5μg/ml)组相比,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),其中ZBPY含药血清预处理组细胞凋亡率低于空白血清预处理组(P<0.05);同时流式细胞结果再次证实ZBPY含药血清预处理组细胞死亡率低于空白血清预处理组(P<0.05)。3.Western blot实验显示,与空白对照组相比,Tm刺激24h后,GRP78与CHOP蛋白表达明显增强(P<0.05);10%空白血清组及10%ZBPY含药血清组与空白对照组相比, GRP78与CHOP蛋白表达无显著差异;各浓度ZBPY含药血清预处理组与Tm组相比GRP78与CHOP蛋白表达显著增强(P<0.05);10%ZBPY含药血清预处理组与10%空白血清预处理组相比,GRP78与CHOP蛋白表达减弱(P<0.05)。结论:1.滋补脾阴方药对ERS引起的神经元损伤有显著保护作用;2.滋补脾阴方药能够抑制内质网应激神经元凋亡,其抑制作用呈药物浓度依赖性;3.滋补脾阴方药对ERS神经元凋亡的抑制作用可能是通过下调内质网应激标志性分子GRP78和CHOP的表达而实现的,这提示滋补脾阴方药影响神经元凋亡可能与内质网途径相关。

全文目录

一、正文  5-34
  （一）中文摘要  5-7
  （二）英文摘要  7-10
  （三）前言  10-11
  （四）材料与方法  11-20
  （五）结果  20-23
  （六）讨论  23-30
  （七）结论  30-31
  （八）参考文献  31-34
二、文献综述  34-45
  （一）综述  34-42
  （二）参考文献  42-45
三、致谢  45-47

滋补脾阴药物血清对内质网应激神经元凋亡的影响及其机制

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