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高渗、低温和氧化条件下酵母细胞应激产生活性物质的研究

作　者: 王玉
导　师: 路福平
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 高渗应激低温应激氧化应激活酵母细胞衍生物耐高渗突变株蛋白质电泳抗氧化作用
分类号: R371
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

本论文对酵母细胞在高渗、低温和氧化条件下的应激反应进行了研究,筛选了耐高渗酵母突变株,通过低剂量刺激酵母细胞产生活性衍生物—LYCD,开辟了制备LYCD的新途径,考察了LYCD对氧化损伤的酵母细胞的保护作用。采用对数期正常酵母细胞为研究对象,对其进行低剂量高渗（KCl）和氧化（H₂O₂）预处理后发现细胞对更高剂量产生了抗性,并且这种抗性具有自我适应性和交叉适应性。此外,在低温和氧化应激反应之间也存在交叉适应性。这种交叉适应性说明,高渗和氧化应激、低温和氧化应激对细胞的损伤在一定程度上具有相似性,预处理后可能诱导出相似的保护物质。测定了酵母经高渗、低温和氧化预处理前后细胞内几种重要抗氧化剂（GSH、SOD、CAT）和总抗氧化能力（T-AOC）的变化,结果表明:预处理都可以使正常酵母细胞中抗氧化剂含量提高,总抗氧化能力增强。并分析了正常酵母预处理前后细胞内脂质过氧化物—丙二醛（MDA）的含量,发现预处理后,再置于氧化致死条件下,MDA的含量降低,细胞的存活率也升高。这不仅说明预处理使细胞抗氧化水平提高,减少了MDA的积累,细胞增加了对这几种不良环境的抗性,更直接说明高渗、低温与氧化关系密切。将经过高渗和低温预处理后的酵母进行破壁,分别得到LYCD_KCl和LYCD_LT,发现两者都对细胞抗氧化具有保护活性。分别对其处理条件进行优化,确定了LYCDK_KCl的最佳处理条件为:1%KCl预处理90min,LYCD_LT的最佳处理条件为:4℃预处理60min。通过紫外诱变筛选了耐高渗酵母突变株（CYK）,与正常酵母相比,发现耐高渗突变株对氧化具有很强的抗性,而且耐高渗酵母提取物（LYCDK）也具有保护细胞抵抗氧化的能力。分析了正常酵母和耐高渗酵母以及预处理对耐高渗酵母细胞内GSH、SOD、CAT、T-AOC和MDA的差异,发现耐高渗酵母胞内抗氧化水平高于正常酵母菌株,且预处理增加了LYCDK中抗氧化剂的含量,降低了MDA水平。对正常酵母细胞预处理前后蛋白的变化进行了电泳分析,结果表明,一些蛋白是H₂O₂和KCl都可诱导合成的,另一些蛋白是由H₂O₂或KCl特异性诱导合成的。探讨了H₂O₂和紫外线条件下,LYCD对酵母细胞氧化损伤的保护作用。在H₂O₂（10mmol/L）和紫外线（20W紫外灯下30cm处照射60s）氧化损伤酵母细胞模型中添加LYCD后,细胞存活率显著上升,且有剂量依赖性。LYCD提高了紫外线氧化损伤细胞上清液中GSH、SOD和CAT含量,降低了MDA水平。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-8
1.前言  8-20
  1.1 自由基与氧化应激  8-10
    1.1.1 自由基理论  8
    1.1.2 细胞内活性氧的生成  8
    1.1.3 自由基对生命大分子物质的损害  8-10
    1.1.4 氧化应激反应  10
  1.2 酿酒酵母的应激反应  10-14
    1.2.1 酿酒酵母的氧化防护体系  10-13
    1.2.2 酿酒酵母的高渗应激反应  13
    1.2.3 酿酒酵母的低温应激反应  13-14
  1.3 应激反应中的调节机制  14-15
    1.3.1 bZIP转录因子  14
    1.3.2 与Cu结合的转录因子  14-15
    1.3.3 锌指转录因子  15
    1.3.4 转录抑制因子  15
    1.3.5 信号转导途径  15
  1.4 功能性化妆品—活酵母细胞衍生物  15-18
    1.4.1 衰老的自由基理论  15-16
    1.4.2 皮肤衰老与氧自由基  16-17
    1.4.3 活酵母细胞衍生物的应用  17-18
  1.5 本课题的立题依据及研究内容  18-20
    1.5.1 立论依据  18-19
    1.5.2 论文研究的主要内容  19
    1.5.3 论文研究的意义  19-20
2.材料与方法  20-32
  2.1 材料  20-21
    2.1.1 菌种  20
    2.1.2 培养基  20
    2.1.3 试剂  20-21
    2.1.4 仪器  21
  2.2 实验方法  21-32
    2.2.1 斜面菌种的活化  21
    2.2.2 种子培养方法  21
    2.2.3 生长曲线的测定方法  21-22
    2.2.4 细胞数的测定  22
    2.2.5 高渗应激实验  22
    2.2.6 氧化应激实验  22
    2.2.7 活性酵母细胞衍生物(LYCD、LYCDK)和酵母提取物(YE、YEK)的制备  22-23
    2.2.8 蛋白含量的测定  23
    2.2.9 样品中GSH含量的测定  23-24
    2.2.10 SOD酶活力的测定  24-25
    2.2.11 CAT酶活力的测定  25
    2.2.12 样品中丙二醛浓度的测定  25-26
    2.2.13 总抗氧化能力(T-AOC)的测定  26
    2.2.14 SDS-PAGE垂直板电泳  26-27
    2.2.15 LYCD对H_2O_2氧化损伤酵母细胞的保护作用  27
    2.2.16 酵母细胞总DNA的提取  27-28
    2.2.17 高渗诱导的LYCD对酵母细胞紫外线氧化损伤的保护作用  28-29
    2.2.18 LYCD制备条件的优化  29
    2.2.19 抗极端环境酵母菌的筛选—耐高渗突变株的筛选  29-30
    2.2.20 抗极端环境酵母突变株和正常酵母在普通培养条件下应激反应的比较  30-31
    2.2.21 耐高渗突变株细胞内抗氧化剂成分的分析及预处理对其影响  31
    2.2.22 低温与氧化应激的适应性反应  31
    2.2.23 低温预处理对LYCD中抗氧化剂活性和MDA含量的影响  31-32
3 结果与讨论  32-54
  3.1 高渗条件对酵母细胞活性衍生物的影响  32-49
    3.1.1 实验菌株的培养及出发菌株生长曲线的绘制  32
    3.1.2 酵母细胞的高渗应激反应  32-34
    3.1.3 酵母细胞的氧化应激反应  34-36
    3.1.4 预处理对细胞内抗氧化剂的影响  36-37
    3.1.5 预处理对细胞内脂质过氧化水平的影响  37-38
    3.1.6 预处理对酵母细胞内蛋白质的影响  38-39
    3.1.7 高渗诱导的LYCD对H_2O_2氧化损伤酵母细胞的保护作用  39-41
    3.1.8 高渗诱导的LYCD对酵母细胞紫外线氧化损伤的保护作用  41-45
    3.1.9 LYCD制备条件的优化  45-47
    3.1.10 耐高渗突变株的选育  47-48
    3.1.11 耐高渗突变株的氧化应激反应  48
    3.1.12 耐高渗突变株细胞内抗氧化剂成分的分析及预处理对其影响  48-49
  3.2 低温条件下活性酵母衍生物的研究  49-54
    3.2.1 低温与氧化应激的适应性实验  49-50
    3.2.2 低温预处理对LYCD中抗氧化剂活性的影响  50
    3.2.3 低温对细胞内脂质过氧化水平的影响  50-51
    3.2.4 低温诱导的LYCD条件优化  51-52
    3.2.5 低温诱导的LYCD对酵母细胞氧化损伤的保护作用  52-54
4.结论与展望  54-57
  4.1 结论  54-55
  4.2 论文的创新点  55
  4.3 展望  55-57
5.参考文献  57-61
6.致谢  61-62
7.攻读硕士学位论文期间发表的论文  62

高渗、低温和氧化条件下酵母细胞应激产生活性物质的研究

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