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对羟基苯乙腈水解酶产生菌的选育及转化过程研究

作　者: 吴明火
导　师: 郑裕国
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 腈水解酶 腈水合酶 对羟基苯乙腈 生物转化 对羟基苯乙酸 反应动力学
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


对羟基苯乙酸是一种重要的有机合成中间体，其应用领域覆盖医药、农药、液晶材料等多方面。本论文旨在筛选得到能有效水解对羟基苯乙腈生产对羟基苯乙酸的菌种，并研究建立对羟基苯乙腈的生物转化工艺路线。论文建立了基于以对羟基苯乙腈为唯一氮源富集、薄板层析法（TLC）定性检测产物的高通量筛选方法。应用该方法，并结合高效液相色谱（HPLC）定量检测产物，筛选得到了8株目的菌株，对其中的菌株E9进行了鉴定，确定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。论文考察了枯草芽孢杆菌E9（Bacillus subtilis E9）的培养和产酶条件，在较优的培养基（葡萄糖13.5g／L，酵母粉6.5g／L、（NH4）2SO45.5g／L、K2HPO4 6.6g／L、KH2PO4 0.5g／L、MgSO4 0.5g／L、FeCl2 0.01g／L）中，可以显著提高枯草芽孢杆菌E9（B.subtilis E9）腈水解酶活力。实验结果表明枯草芽孢杆菌E9（B.subtilis E9）腈水解酶是组成型酶，其活力与细胞生长相关。利用筛选得到的枯草芽孢杆菌E9（B.subtilis E9），考察了全细胞生物催化水解羟基苯乙腈的生物转化过程，研究了细胞催化的酶学性质。枯草芽孢杆菌E9（B.subtilis E9）可以水解多种腈化合物生成相应的酸，在本文试验的底物中，对羟基苯乙腈为最适底物。在对羟基苯乙腈转化为对羟基苯乙酸的静息细胞生物催化过程中，最适反应温度约为32.5℃，最适初始pH值为8.0—9.0。Cu2+、Co2+、Hg2+、Ni+等对细胞腈水解酶活性具有明显的抑制作用，Ba2+、Mg2+具有较明显的激活作用，底物和产物在浓度高于1g／L时对细胞腈水解酶活力均有抑制作用。静息细胞生物催化反应动力学研究表明，酶促反应的表观米氏常数Km及底物抑制常数Ks分别为1.254mmol／L和9.218mmol／L，反应速率最大时的底物浓度为0.446g／L。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
目录  9-13
第一章 绪论  13-31
  1.1 前言  13-14
  1.2 腈水解酶的来源  14-19
  1.3 底物的特异性  19-20
  1.4 酶的结构  20-22
  1.5 反应机理  22-23
  1.6 本课题研究的背景、内容和意义  23-26
    1.6.1 研究背景及意义  23-25
    1.6.2 研究内容  25
    1.6.3 研究意义  25-26
  参考文献  26-31
第二章 腈水解酶产生菌的筛选与鉴定  31-50
  2.1 引言  31
  2.2 菌种筛选  31-37
    2.2.1 材料与方法  31-37
      2.2.1.1 土样  31-32
      2.2.1.2 试剂  32
      2.2.1.3 主要仪器  32-33
      2.2.1.4 筛选路线  33
      2.2.1.5 富集培养  33
      2.2.1.6 菌体培养与制备  33
      2.2.1.7 转化  33-34
      2.2.1.8 检测方法  34-37
    2.2.2 结果与讨论  37
  2.3 菌种鉴定  37-48
    2.3.1 材料与方法  38-43
      2.3.1.1 材料  38-39
      2.3.1.2 方法  39-43
    2.3.2 结果与讨论  43-48
      2.3.2.1 形态观察  43-46
      2.3.2.3 仪器鉴定结果  46
      2.3.2.4 分子鉴定结果  46-48
  2.4 小结  48-49
  参考文献  49-50
第三章 菌株B.subtilis E9产腈水解酶的条件研究  50-74
  3.1 引言  50
  3.2 液体种子的生长曲线  50-52
    3.2.1 材料与方法  50-51
      3.2.1.1 材料  50
      3.2.1.2 方法  50-51
    3.2.2 结果与讨论  51-52
      3.2.2.1 菌体干重与OD的标准曲线  51-52
      3.2.2.2 液体种子的生长曲线  52
  3.3 细胞活力与培养时间的关系  52-54
    3.3.1 材料与方法  52-53
      3.3.1.1 材料  52
      3.3.1.2 方法  52-53
    3.3.2 结果与讨论  53-54
  3.4 细胞腈水解酶活力的遗传稳定性  54-55
    3.4.1 材料与方法  54
      3.4.1.1 材料  54
      3.4.1.2 方法  54
    3.4.2 结果与讨论  54-55
  3.5 不同碳源对细胞活力的影响  55-56
    3.5.1 材料与方法  55
      3.5.1.1 材料  55
      3.5.1.2 方法  55
    3.5.2 结果与讨论  55-56
  3.6 不同氮源对细胞活力的影响  56-57
    3.6.1 材料与方法  56-57
      3.6.1.1 材料  56
      3.6.1.2 方法  56-57
    3.6.2 结果与讨论  57
  3.7 不同添加剂对细胞活力的影响  57-60
    3.7.1 材料与方法  57-58
      3.7.1.1 材料  58
      3.7.1.2 方法  58
    3.7.2 结果与讨论  58-60
  3.8 金属离子对细胞活力的影响  60-61
    3.8.1 材料与方法  60
      3.8.1.1 材料  60
      3.8.1.2 方法不同培养基的产酶效果比较  60
    3.8.2 结果与讨论  60-61
  3.9 显著性因子的检出  61-63
    3.9.1 材料与方法  61-62
      3.9.1.1 材料  61-62
      3.9.1.2 方法  62
    3.9.2 结果与讨论  62-63
  3.10 线性回归正交法优化产酶条件  63-67
    3.10.1 材料与方法  63-64
      3.10.1.1 材料  63
      3.10.1.2 方法  63-64
    3.10.2 结果与讨论  64-67
  3.11 最速上升法  67-69
    3.11.1 材料与方法  67-68
      3.11.1.1 材料  67-68
      3.11.1.2 方法  68
    3.11.2 结果与讨论  68-69
  3.12 Ca~(2+)及Fe~(2+)对细胞活力的影响  69-71
    3.12.1 材料与方法  69-70
      3.12.1.1 材料  69
      3.12.1.2 方法  69-70
    3.12.2 结果与讨论  70-71
  3.13 接种量的确定  71-72
    3.12.1 材料与方法  71
      3.12.1.1 材料  71
      3.12.1.2 方法  71
    3.12.2 结果与讨论  71-72
  3.13 小结  72-73
  参考文献  73-74
第四章 整体细胞生物转化对羟基苯乙腈的酶学性质及反应过程研究  74-94
  4.1 引言  74
  4.2 酶种类的鉴别  74-76
    4.2.1 材料与方法  74-75
      4.2.1.1 材料  74-75
      4.2.1.2 方法  75
    4.2.2 结果与讨论  75-76
  4.3 细胞的底物特异性  76-77
    4.3.1 材料与方法  76-77
      4.3.1.1 材料  76
      4.3.1.2 方法  76-77
    4.3.2 结果与讨论  77
  4.4 温度的影响  77-80
    4.4.1 材料与方法  77-78
      4.4.1.1 材料  77
      4.4.1.2 方法  77-78
    4.4.2 结果与讨论  78-80
      4.4.2.1 转化最适温度  78-79
      4.4.2.2 细胞的热稳定性  79-80
  4.5 pH的影响  80-82
    4.5.1 材料与方法  80-81
      4.5.1.1 材料  80
      4.5.1.2 方法  80-81
    4.5.2 结果与讨论  81-82
  4.6 金属离子对细胞的活性影响  82-83
    4.6.1 材料与方法  82-83
      4.6.1.1 材料  82
      4.6.1.2 方法  82-83
    4.6.2 结果与讨论  83
  4.7 底物浓度的影响  83-84
    4.7.1 材料与方法  83-84
      4.7.1.1 材料  83-84
      4.7.1.2 方法  84
    4.7.2 结果与讨论  84
  4.8 细胞浓度对反应的影响  84-85
    4.8.1 材料与方法  84-85
      4.8.1.1 材料  84-85
      4.8.1.2 方法  85
    4.8.2 结果与讨论  85
  4.9 产物浓度对反应的影响  85-86
    4.9.1 材料与方法  85-86
      4.9.1.1 材料  85-86
      4.9.1.2 方法  86
    4.9.2 结果与讨论  86
  4.10 离子强度对细胞活力的影响  86-87
    4.10.1 材料与方法  86-87
      4.10.1.1 材料  86-87
      4.10.1.2 方法  87
    4.10.2 结果与讨论  87
  4.11 反应动力学  87-92
    4.11.1 材料与方法  87-88
      4.11.1.1 材料  87-88
      4.11.1.2 方法  88
    4.11.2 结果与讨论  88-92
      4.11.2.1 产物形成过程  88-89
      4.11.2.2 底物消耗与产物形成的关系  89
      4.11.2.3 细胞的K_m及K_s  89-92
  4.12 小结  92-93
  参考文献  93-94
第五章 总结与建议  94-97
  5.1 总结  94-95
  5.2 建议  95-97
附录  97-99
攻读学位期间发表的论文  99-100
致谢  100

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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