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呼吸道合胞病毒G蛋白候选疫苗对小鼠免疫功能的影响

作　者: 田君
导　师: 井申荣
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 呼吸道合胞病毒 GCX3C GCTL LT
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是一种能导致婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体。感染后出现急性支气管炎、肺炎、严重者甚至死亡。截止目前还没有一种安全有效的疫苗得到应用。本研究通过将截短的RSV G 130-230位氨基酸(包含有CX3C模序)与GCTL(用CTL表位替换了CX3C)或辅以黏膜佐剂后免疫Balb/c小鼠,来分析和评价疫苗对小鼠免疫功能的影响。Gcx3c蛋白和GCTL蛋白在大肠杆菌中表达。表达的蛋白,应用His-Tag与Co2+的亲和力对蛋白进行纯化。将纯化后的Gcx3c蛋白、GCTL蛋白分别与无毒型大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labil enterotoxin, LT)混合后免疫Balb/c小鼠,设立Gcx3c组；GCTL组；GCTL组；GCTL+LT组；LT组；PBS组,共6组,分别在0,1,4周免疫。免疫结束后,针对血清中的IgG、IgA、IgG2a/IgG1、呼吸道sIgA、组胺、嗜酸性粒细胞以及淋巴细胞体外增殖、CTL应答效应等免疫指标分别通过ELISA、HE染色以及MTT染色法等进行测定。用107 pfu/ml RSV滴鼻攻击免疫后的小鼠,连续3天。攻毒结束后处死小鼠,计数嗜酸性粒细胞,检测组胺水平,并制备组织切片。结果使用SPSS16.0软件进行分析。Gcx3c蛋白和GCTL蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式大量表达,在37℃下诱导的包涵体占到总蛋白的40%以上。应用His-tag与金属离子的亲和力纯化后纯度达到95%以上,Western blotting结果证明所表达的是目的蛋白。免疫检测结果表明：血清IgG在第二次免疫后,GCTL、GCTL+LT组抗体滴度显著高于Gcx3c+LT及Gcx3c(P<0.05),且以上四组均高于LT及PBS组(P<0.001)：血清IgA在第二次免疫后,GCTL、GCTL+LT组抗体滴度显著高于Gcx3c及Gcx3c+LT(P<0.05),且以上四组均高于LT及PBS组(P<0.05)；而在sIgA中,加了LT佐剂的两个实验组的sIgA抗体滴度显著高于Gcx3c、GCTL、LT、PBS组(P<0.05)；血清IgG2a/IgG1中GCTL组平衡效果优于GCTL+LT、GCX3C+LT、GCX3C组(P<0.05),GCTL组在用CTL表位替换了CX3C模序后,Th1/Th2趋于平衡,并且还发现加入了佐剂LT后能发挥一个协调Th1/Th2的生理作用,有调节免疫反应极化的情况；淋巴细胞体外增殖实验中,抗原刺激后,只有相应的Gcx3c和GCTL蛋白组细胞出现了增殖,对照组和佐剂组都没有增殖,且蛋白组细胞增殖量显著高于对照组(P<0.05)；比较Gcx3C、GcTL组以及PBS组的组胺,GCX3C组胺含量明显高于其他两组(P<0.05),GcTL与PBS组间无显著差异(P>0.05)；Gcx3c+LT组的嗜酸性粒细胞数量高于GCTL、GCTL+LT、PBS组(P<0.05),而后三组之间数量无显著差异(P>0.05)；组织切片结果也显示,GCTL蛋白组小鼠肺部没有出现炎症反应,而GCX3C蛋白组则有明显的炎症反应；RSV特异性CTL应答结果表明,GCTL组诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性,而GCX3C在针对病毒时也存在一定程度的杀伤。攻毒检测结果表明：攻毒后GCTL组嗜酸性粒细胞数量显著低于GCX3C组、PBS组和LT组(P<0.05)；GCX3C组的组胺含量显著高于GCTL组(P<0.05)；肺表和组织切片结果显示,GCTL蛋白组小鼠肺没有明显病变,而GCX3C组、PBS组和LT组则出现了严重的病变。本实验成功的表达纯化了GCX3C、GCTL和LT蛋白,并就疫苗对小鼠免疫功能的影响和攻毒后的保护能力进行了测定。实验结果显示,混以LT佐剂后,提高了黏膜部的sIgA的量。针对GCX3C进行的改造是成功有效的,GCTL增强了对RSV特异性的CTL应答反应,并且有效的降低了呼吸道组胺和嗜酸性粒细胞的数量,避免了再次感染的过激反应。攻毒后的部分实验结果也从一个侧面体现了GCTL在保护性方面发挥了应有的作用。呼吸道合胞病毒G蛋白亚单位疫苗的小鼠实验,为进一步的研究RSV致病机理及RSV疫苗的研发奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
插图和附表清单  10-11
缩略语索引  11-12
第一章文献综述  12-18
  1.1 呼吸道合胞病毒  12
  1.2 呼吸道合胞病毒特征  12-13
  1.3 主要蛋白性质  13-15
    1.3.1 具有融合能力的F蛋白(Fusion protein)  13
    1.3.2 小疏水性蛋白(Small hydrophobic protein,SH)  13-14
    1.3.3 具有吸附能力的G蛋白(Glycoprotein)  14-15
  1.4 目前RSV疫苗的进展情况  15-18
    1.4.1 F1-RSV  15
    1.4.2 减毒活疫苗  15
    1.4.3 亚单位疫苗  15-17
    1.4.4 结语  17-18
第二章前言  18-20
第三章目的蛋白在大肠杆菌中的的表达与纯化  20-39
  3.1 材料和方法  20-30
    3.1.1 材料  20-24
    3.1.2 方法  24-30
  3.2 结果  30-36
    3.2.1 重组质粒G_(CX3C)/pET22b和G_(CTL)/pET22b酶切鉴定  30-31
    3.2.2 重组G_(CX3C)蛋白和G_(CTL)蛋白的表达  31-33
    3.2.3 Western Blotting鉴定结果  33-34
    3.2.4 G_(CX3C)和G_(CTL)蛋白的纯化  34-36
  3.3 讨论  36-38
    3.3.1 G_(CX3C)/pET22b和G_(CTL)/pET22b酶切鉴定  36
    3.3.2 重组G_(CX3C)蛋白和G_(CTL)蛋白的高效表达  36
    3.3.3 Western blotting鉴定结果  36-37
    3.3.4 目的蛋白的纯化  37-38
  3.4 小结  38-39
第四章 G蛋白候选疫苗对小鼠免疫功能的影响  39-65
  4.1 材料和方法  39-49
    4.1.1 材料  39-42
    4.1.2 方法  42-48
    4.1.3 数据统计  48-49
  4.2 结果  49-59
    4.2.1 考马斯亮蓝标准曲线  49
    4.2.2 小鼠血液中嗜酸性粒细胞计数  49-50
    4.2.3 小鼠血清中G蛋白特异性抗体IgG的检测  50-51
    4.2.4 小鼠血清中G蛋白特异性抗体IgA的检测  51-52
    4.2.5 小鼠肺及气管灌洗液中G蛋白特异性抗体IgA,即sIgA的检测  52-53
    4.2.6 小鼠血清中G蛋白特异性抗体IgG2a/IgG1的检测  53
    4.2.7 小鼠肺及气管组织匀浆液中组胺的检测  53-54
    4.2.8 小鼠体外淋巴细胞增殖实验的检测  54-55
    4.2.9 HE染色组织切片  55-57
    4.2.10 RSV特异性CTL应答  57-59
  4.3 讨论  59-64
    4.3.1 LT佐剂的使用  59
    4.3.2 不同实验组嗜酸性粒细胞数量的差异  59-60
    4.3.3 免疫指标的检测  60-64
  4.4 小结  64-65
第五章 G蛋白候选疫苗对小鼠保护性的研究  65-78
  5.1 材料和方法  65-69
    5.1.1 材料  65-66
    5.1.2 方法  66-68
    5.1.3 数据统计  68-69
  5.2 结果  69-75
    5.2.1 攻毒后小鼠血液中嗜酸性粒细胞计数  69
    5.2.2 攻毒后小鼠肺及气管组织匀浆液中组胺的检测  69-70
    5.2.3 攻毒后肺部形态与HE染色组织切片  70-75
  5.3 讨论  75-77
    5.3.1 不同实验组嗜酸性粒细胞数量的差异  75
    5.3.2 组胺检测结果  75
    5.3.3 肺表面形态与HE染色组织切片  75-77
  5.4 小结  77-78
第五章全文总结  78-80
第六章展望  80-81
致谢  81-82
参考文献  82-85
附录A  85

呼吸道合胞病毒G蛋白候选疫苗对小鼠免疫功能的影响

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