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AP-1信号传导通路细胞模型的建立

作　者: 关冰
导　师: 蒋澄宇
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 医科大学细胞模型荧光显微镜硕士研究生毕业论文高通量筛选细胞株协和绿色荧光蛋白细胞培养
分类号: Q26-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

AP-1(activator protein-1)，是细胞接受外界刺激调节生物反应的一个重要的生物感受器。它是由Fos，Jun，ATF和MAF蛋白家族组成的同源或异源二聚体，属于亮氨酸拉链转录因子家族成员，在哺乳动物细胞中以Fos和Jun为主，其中c-Fos和c-Jun组成的异源二聚体是其最稳定的形式。AP-1信号传导通路可以被生长因子，炎性细胞因子，UV和离子辐射，细胞应激，细菌和病毒感染，肿瘤转化剂等多种刺激激活。激活后的AP-1与TPA反应元件(TRE:5’ TGAC／GTCA-3’)结合，调节下游基因表达。 AP-1作为对外界信号发生反应的转录因子而且位于信号级联反应的末端，使外界信号和细胞功能之间建立起一定的联系。有研究发现AP-1蛋白的激活与细胞的增生，分化，转化，凋亡，感染，生存和死亡，以及免疫反应相关。那么寻找AP-1蛋白的激活物，无疑对于人类对抗肿瘤，感染，凋亡等疾病以及对生长发育的认识具有重要的意义。本项研究即以构建AP-1信号传导通路高通量筛选细胞模型为目的，用于高通量筛选可以激活此信号传导通路的未知因子，以及高通量的分析某些药物在体内作用的特异性和效率，用以发现新药以及阐明某些药物的作用机制，为AP-1的研究提供一个简单有效的方法和工具。在本研究中，将AP-1的顺式作用元件TRE序列人工合成，与绿色荧光蛋白的基因连接，插入含有抗嘌呤霉素基因的载体。将载体整合入293E细胞的基因组中，利用嘌呤霉素筛选出稳定表达的细胞株，再利用敏感药物TPA，筛选出背景低而且敏感性高的细胞株作为信号传导模型。当有相应刺激作用于细胞时，通过一系列的激酶级联发应，激活AP-1蛋白，并转位进入细胞核，特异性结合于TPA反应元件TRE，诱导绿色荧光蛋白的表达，细胞发出绿色荧光。通过绿色荧光有或无的变化，确定该刺激是否能够有效的激活AP-1信号传导通路。实验结果表明，成功建立了高效敏感的细胞通路模型，此模型具有操作简便，敏感性高，背景低，结果稳定等优点，可用于大规模高通量的药物筛选及分析。

AP-1信号传导通路细胞模型的建立

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